蘿卜游離小孢子成胚誘導影響因素研究進展

李曉梅 冉茂林 楊峰

摘 要：綜述了影響蘿卜小孢子培養中胚狀體發生的主要因素，包括基因型、小孢子發育時期、小孢子的處理方式、培養基類型及其添加物等，同時提出了該技術存在的問題，并展望了這項技術在研究和生產實踐中的應用前景。

關鍵詞：蘿卜；游離小孢子培養； 胚狀體誘導；影響因素

中圖分類號：S631.1 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）14-0041-04

蘿卜（Raphanus sativus L.）為十字花科蘿卜屬的一二年生草本植物，以肥大肉質根為產品器官，是我國重要的蔬菜作物。異花授粉作物的雜種優勢明顯，在蘿卜雜交優勢育種中，人們多利用雄性不育系與自交系所產生的F1代的雜種優勢來提高其品質、產量和抗病性。遺傳性穩定的純合自交系是必不可少的親本材料，常規選育方法獲得一個穩定、純合的自交系一般需要7～8代，費工費時，且長期自交還會出現衰退現象。而運用游離小孢子培養獲得純系是一種行之有效的方法，運用該技術可在2 a內獲得遺傳穩定的雙單倍體（Doubled haploid，DH）植株，從而大大縮短育種周期，提高育種效率。同時由于隱性性狀能在DH植株上直接表達，可提高優異重組體與突變體的選擇效率，除此之外DH植株還可用于遺傳圖譜的構建與分子標記等基礎研究，小孢子和小孢子胚也是遺傳轉化的理想受體，因此小孢子游離培養技術應用前景廣闊[1]。

1989年，Lichter[2]首次通過小孢子培養技術成功獲得蘿卜胚狀體。此后，國內外諸多學者對蘿卜游離小孢子技術開展了系統的研究。本文對20多a來國內外有關蘿卜游離小孢子培養所取得的成果及其影響因素進行綜述，并以此提出蘿卜小孢子培養中現存的問題以及對未來的展望。

1 影響蘿卜小孢子成胚誘導的內在因素

1.1 供體材料的基因型

供體植株的基因型是影響小孢子培養的關鍵因素，是小孢子胚胎發生起動與否的內在因素，且不同基因型之間小孢子胚胎的發生頻率存在顯著差異。1996年，Takahata等[3]對11份蘿卜材料進行游離小孢子培養，其中只有6份材料獲得了胚狀體，其基因型發生范圍為54.5%，胚胎發生率為0.2～8.3個/105個游離小孢子。隨后張麗[4]用20個不同類型蘿卜品種為試材，進行游離小孢子培養技術初步研究，發現只有山東板葉心里美1個品種能夠形成胚，陳文輝等[5]、周志國等[6]、張振超[7]的研究同樣證實了不同基因型蘿卜胚狀體發生率間存在顯著差異。王春麗等[8]進一步研究發現，在22份蘿卜材料中，有12份材料獲得了胚狀體，出胚材料中90%以上為雜種一代，表明蘿卜雜種一代較常規品種易出胚，這與趙艷玲[9]的研究結果一致，可能的原因是蘿卜胚胎發生能力同其他被證實了的十字花科作物一樣，是受染色體上某些基因位點控制，因而表現出較強的雜種優勢。

1.2 小孢子發育時期

大多數植物小孢子培養的最佳時期為單核靠邊期至雙核早期，然而小孢子的發育時期與花蕾形態指標相關。花蕾長度是最早用于判定蘿卜小孢子發育時期的外在標準。Takahata等[3]發現蘿卜材料Chugoku-ao、Sushirazu-shogoin及Minikon的花蕾長度分別為3～4 mm、5～6 mm、4～5 mm時，其小孢子處于單核靠邊期至雙核早期，此時培養的小孢子胚狀體誘導率最高；周志國等[6]、龍雯虹[10]同樣證實，不同基因型的小孢子處于單核靠邊期至雙核早期的花蕾長度不同。李丹等[11]以4份不同蘿卜材料為試材，研究了花蕾不同形態指標與小孢子發育時期的關系，結果表明不同材料花蕾縱徑、花蕾橫徑、花瓣長、花藥長存在極顯著差異，試驗材料處于單核靠邊期時的花蕾縱徑變幅為2.99～3.51 mm，橫徑為2.11～2.49 mm，花蕾縱橫徑比為1.41～1.48，花藥長度為2.05～2.51 mm，花藥寬度為0.83～0.95 mm，花瓣長度為1.89～2.56 mm，瓣藥比為0.92～1.06，相比較而言，小孢子發育適期瓣藥比在不同材料間的差異相對較小，更適合作為不同材料取樣適期的鑒定指標和尺度，這與趙艷玲[9]的研究結果一致。Changhoo等[12]的研究表明，不同蘿卜品種小孢子培養最佳花蕾長度在2.5～6.5 mm，但其總體特征是當花瓣約短于柱頭長度時小孢子處于單核晚期的比例最大。雖然花蕾形態可作為判斷小孢子發育時期的指標，但它隨著供體植株基因型、生長條件、生長時間、花序等的變化而變化，故在每次培養前，應對小孢子發育時期進行鑒定。

2 影響蘿卜游離小孢子成胚誘導的外因

2.1 材料的處理

在進行小孢子培養時對其進行處理，可改變小孢子的生理狀態，使分裂方式和發育途徑發生變化，促進胚狀體的形成，提高胚狀體發生率，這項措施在諸多植物上取得了成功。應用在蘿卜小孢子培養中的處理方式主要有低溫、熱激、饑餓脅迫、添加甘露醇與秋水仙素等方法。

①低溫預處理 據許多研究者報道，低溫處理可改變花粉第2次有絲分裂的軸向，使正常的不對稱的有絲分裂被破壞而進行對稱分裂，形成2個均等的細胞，從而向孢子體途徑發展。在進行小孢子培養之前，對花序上的花蕾進行低溫預處理，可提高胚狀體的誘導。陳文輝等[5]證明3℃低溫處理24 h可顯著提高材料胚誘導率，但隨著處理時間的延長，誘導率反而下降，超過48 h小孢子不發育。付傳翠等[13]則認為，4℃低溫處理3 d可提高小孢子存活率，但隨著時間推遲其存活率下降。李丹[14]認為不同基因型材料適宜的低溫處理時間不同，蘿卜小孢子低溫預處理的適宜時間為1～3 d，小孢子的存活率隨時間的延長呈下降趨勢。然而白小娟等[15]、王春麗等[8]則認為單純的低溫處理對小孢子的發育沒有影響。

②高溫熱激處理 自從Keller等[16]在甘藍型油菜花藥培養中，首次用高溫處理提高花粉胚的誘導率獲得成功后，該方法被廣泛應用于植物游離小孢子培養中。其作用機理可能是高溫處理改變了小孢子發育途徑，阻止小孢子向成熟花粉粒方向發展，從而促進其由配子體發育轉變為小孢子體發育而誘導胚的形成。Takahata等[3]首次研究表明，32.5℃高溫處理是蘿卜小孢子胚狀體發生的必須條件，但其最佳時間隨著基因型變化而變化。趙艷玲[9]對3個蘿卜材料用32.5℃高溫熱激處理（0、24、48、72、96 h）后，發現當3種基因型熱激0、96 h時小孢子存活率和胚狀體誘導率全是0，說明小孢子沒有經過高溫熱激就不能膨大進而啟動分裂，而熱激96 h后的小孢子可能經過長時間的高溫已經死亡，當小孢子熱激48 h存活率和胚狀體誘導率與其他4個處理呈顯著差異。大量研究表明，高溫熱激處理可顯著提高蘿卜小孢子成胚誘導率，甚至是誘導成胚的必要條件，其最佳處理溫度為32～33℃，最佳處理時間為24～48 h[5～8，10～12，15]。

③其他處理方式 在蘿卜小孢子培養中，見報道的除上述2種處理方式外，還有饑餓脅迫、添加甘露醇及秋水仙素等處理方式。付傳翠等[13]研究表明，饑餓處理反而會降低蘿卜小孢子成活率，甘露醇及秋水仙素處理能提高蘿卜小孢子存活率，在4份供試材料中3份最適甘露醇處理濃度為5 g/L，1份為15 g/L，而2份材料最適秋水仙素處理濃度為20 mg/L，另2份材料分別為5、10 mg/L。李丹[14]研究了不同濃度甘露醇及處理時間對4份蘿卜材料小孢子存活率的影響，結果在4份材料中，有1份材料對甘露醇不敏感，2份材料經10、15 g/L 的甘露醇預處理后，可保持較好的存活率，還有1份材料經10 g/L甘露醇處理后有較高的小孢子存活率，但是隨著處理時間的延長而下降，可見不同基因型蘿卜最佳甘露醇或秋水仙素處理濃度不同，這與白小娟等[15]的研究結果一致。

2.2 培養基類型及添加物

①基本培養基及蔗糖濃度 蘿卜游離小孢子成胚誘導培養中最常用的是NLN或1/2 NLN基本培養基，其主要特點是大量元素含量較低。陳文輝等[5]研究了NLN與1/2 NLN對蘿卜小孢子胚誘導的影響，發現只有1/2 NLN培養基才能誘導蘿卜小孢子產生胚狀體，然而趙艷玲[9]則認為NLN與

1/2 NLN均可很好地用于蘿卜游離小孢子成胚誘導。蔗糖是小孢子培養中的主要碳源，用來提供能量和維持細胞的滲透壓。有些學者認為，高濃度蔗糖可維持小孢子的活力。目前，蘿卜游離小孢子培養中使用的蔗糖濃度一般為13%[4，6，14]，但陳文輝[5]認為12%蔗糖濃度最適宜蘿卜游離小孢子培養，而Changhoo等[12]比較了1/2 NLN 添加不同濃度蔗糖（10%、13%、15%、20%）對蘿卜小孢子胚誘導的影響，發現低于10%無胚狀體產生，適宜成胚誘導的最優蔗糖濃度為15%，其胚產量可達2.4個/蕾。

②激素 在培養基中，激素的成分對誘發細胞生長與分裂起重要作用，在蘿卜游離小孢子培養中，外源激素對胚形成和植株再生的影響至今沒有取得一致的結果。Lichter[2]最早報道，在培養基中除去植物生長調節劑可提高胚產量。周志國等[6]研究發現，在蘿卜小孢子培養中添加6-BA可明顯促進蘿卜游離小孢子胚狀體的誘導，當濃度為0.1 mg/L時胚產量最高，但畸形胚發生率增加，這與趙艷玲[9]的研究結果一致。李丹[14]則認為添加0.1 mg/L

6-BA+1 mg/L NAA為蘿卜小孢子成胚誘導的最佳激素組合。在實際工作中，大多數均采用不添加激素的培養方式。

③活性炭和硝酸銀 在小孢子離體培養中，無胚胎發生能力的小孢子能釋放出一些有毒物質，可能會抑制具有胚胎發生能力小孢子的胚胎發生及胚狀體的正常發育，因此，在小孢子離體培養中常常會添加一些抑制劑來阻止有害物質的影響，常用的添加物為活性炭和硝酸銀。Lichter[2]指出，活性炭不僅可以吸附培養基中有毒物質，還可以吸附一些必要元素和植物激素，因此，活性炭的濃度不宜太高，否則會起負作用。周志國等[6]認為，添加活性炭可提早出胚時間3～5 d，當加入活性炭濃度為0.8 g/L 時，胚誘導率最高。趙艷玲[9]的研究表明，活性炭最適添加濃度為0.75 g/L，王康[17]研究表明活性炭最適添加濃度為0.1 g/L，張麗等[18]則認為單純添加0.1 g/L活性炭對春白蘿卜離體小孢子成胚沒有明顯的促進作用，需要與4℃低溫處理相結合才能促進胚狀體的發生。硝酸銀為乙烯抑制劑，Changhoo等[12]比較了不同濃度硝酸銀對蘿卜游離小孢子培養的影響，發現0.05 mg/L 硝酸銀為最適濃度，其胚產量為不添加硝酸銀的2倍多，但濃度超過1.0 mg/L后則無胚狀體產生。王康[17]研究發現，添加1～2 mg/L 硝酸銀可提高一些基因型的胚狀體發生頻率，而且在胚狀體誘導愈傷組織產生次生胚的過程中，硝酸銀的添加對次生胚的誘導也起到了一定的促進作用。

3 存在的問題與展望

蘿卜游離小孢子培養研究雖然取得了一定進展，但相對于其他十字花科作物而言其研究深度與廣度還差之甚遠。蘿卜游離小孢子培養技術難點主要表現為成胚誘導能力基因型限制性強、小孢子成胚誘導頻率低以及培養結果重復性差等。現已證實小孢子胚胎發生能力同其他遺傳性狀一樣，是一種受基因調控的遺傳特性[19，20]，因此，可利用品種雜交的手段，將控制高胚胎發生能力的遺傳因子導入到無胚胎或低胚胎發生能力的基因型中，通過遺傳改良的方法擴大蘿卜小孢子胚胎發生的基因型范圍。同時通過優化小孢子培養的各種因素建立完善、高效的再生體系，并使之與常規育種技術相結合應用到育種工作中將是以后研究的重點。另外，應逐步擴大蘿卜游離小孢子技術的應用范圍，將該技術應用于蘿卜種質創新、遺傳轉化、分子標記、遺傳圖譜構建等領域。我們相信，蘿卜游離小孢子培養技術不僅會成為常規育種的一個重要組成部分，而且必將在基礎研究領域發揮更大的作用。

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