銀翹口服液質量標準研究

趙增成 林樹乾 李桂明 黃中利 傅劍 馮敏燕 宋敏訓

摘要：為了建立銀翹口服液的質量標準，采用薄層色譜法（TLC）對處方中的金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、荊芥進行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法（HPLC）對牛蒡苷含量進行測定。結果顯示，TLC色譜斑點清晰、專屬性強、陰性對照無干擾；在0.0622～0.6220 mg/mL范圍內，牛蒡苷濃度與峰面積呈良好的線性關系，平均加樣回收率為102.4%，RSD為2.2%，樣品中牛蒡苷的平均含量為6.7246 mg/mL。本研究所建立的檢測方法簡便、準確、專屬性強、重復性好，可對銀翹口服液的質量進行有效控制。

關鍵詞：銀翹口服液；薄層色譜；高效液相色譜；質量標準

中圖分類號：S859.79文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0124-06

銀翹口服液是本課題組研發的新獸藥，處方源于《溫病條辨》之“銀翹散”，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、桔梗、淡竹葉、甘草等組成，功效為辛涼解表、清熱解毒，主治外感風熱或溫病初起[1～4]。為了制定銀翹口服液的質量標準，本研究采用薄層色譜法對制劑中金銀花、連翹、薄荷、荊芥、牛蒡子進行了鑒別研究，以組方中牛蒡子的主要有效成分牛蒡苷為指標成分，采用高效液相色譜法對其含量進行了測定。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

金銀花對照藥材（批號121060-201107）、綠原酸對照品（批號110753-201114）、連翹對照藥材（批號120908-201016）、連翹苷對照品（批號110821-201110）、薄荷對照藥材（批號120916-201109）、薄荷腦對照品（批號110728-201006）、荊芥對照藥材（批號120911-201110）、牛蒡子對照藥材（批號120903-201109）、牛蒡苷對照品（批號110819-201108），均購置于中國食品藥品檢定研究院。銀翹口服液，由山東昊泰科技藥業有限公司試制。乙睛為色譜純試劑，甲醇、甲酸、異丙醇、三氯甲烷、磷酸等均為分析純試劑。

1.2試驗儀器

安捷倫高效液相色譜儀，AB265-S型雙量程電子天平，KQ5200DB型超聲儀，硅膠G板（青島海洋化工廠），聚酰胺薄膜（青島海洋化工廠）。

1.3試驗方法

1.3.1薄層鑒別①金銀花的薄層鑒別。取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液作為對照品溶液。再取金銀花對照藥材0.2 g，加甲醇5 mL，放置12 h，過濾，取濾液作為對照藥材溶液。另取銀翹口服液10 mL，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min，取上清液水浴蒸干，用甲醇2 mL溶解，放置后取上清液作為供試品溶液。取不含金銀花的銀翹口服液同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗[5]，吸取以上溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以異丙醇-甲醇-甲酸（9∶1∶0.5）的溶液為展開劑，展開，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。

②連翹的薄層鑒別。取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，作為對照品溶液。另取連翹對照藥材1 g，加石油醚（30～60℃）20 mL，超聲處理15 min，過濾，棄去石油醚液，殘渣揮干石油醚，加甲醇20 mL，密塞，超聲處理20 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL溶解，作為對照藥材溶液。取銀翹口服液30 mL，加甲醇60 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min后取上清液蒸干，用2 mL甲醇溶解，放置后取上清液作為供試品溶液。同法將不含連翹的銀翹口服液制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取連翹苷對照品溶液15 μL，連翹對照藥材溶液20 μL，供試品溶液和陰性對照品溶液各30 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

③牛蒡子的薄層鑒別。取牛蒡苷對照品，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對照品溶液。另取牛蒡子對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液。取銀翹口服液10 mL，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min后取上清液蒸干，用2 mL甲醇溶解，放置后取上清液作為供試品溶液。取不含牛蒡子的銀翹口服液同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取對照品溶液、對照藥材溶液各5 μL，吸取供試品溶液、陰性對照液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（40∶8∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

④荊芥的薄層鑒別。取荊芥對照藥材0.8 g，加石油醚（60～90℃）20 mL，密塞，時時振搖，放置過夜，過濾，濾液揮至1 mL，作為對照藥材溶液。取銀翹口服液10 mL，加石油醚（60～90℃）20 mL，超聲處理30 min，置分液漏斗中，靜置后取石油醚層，水浴蒸干，放冷后，用2 mL石油醚（60～90℃）溶解，作為供試品溶液。取不含荊芥的銀翹口服液同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑展開，取出晾干，噴以5%香草醛的5%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

⑤薄荷的薄層鑒別。取薄荷腦對照品，加石油醚（60～90℃）制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。另取薄荷對照藥材0.5 g，加石油醚（60～90℃） 5 mL，密塞，振搖數分鐘，放置30 min，過濾，濾液揮至1 mL，作為對照藥材溶液。再取銀翹口服液10 mL，加20 mL石油醚（60～90℃），超聲處理30 min，置分液漏斗中靜置數分鐘后取石油醚層，水浴蒸干，用2 mL石油醚（60～90℃）溶解，作為供試品溶液。用去除薄荷的銀翹口服液同法制取陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取以上各種溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）為展開劑展開，取出晾干，噴以香草醛硫酸試液-乙醇（1∶4）的混合溶液，100℃加熱至斑點顯色清晰。

1.3.2高效液相色譜法測定牛蒡苷含量 ①色譜條件。在對影響指標成分牛蒡苷分離度和響應值的主要因素（包括色譜柱、柱溫等）進行考察和優化的基礎上，最終確定色譜條件為：Agilent XDB-C18色譜柱，柱溫25℃，流速1 mL/min，進樣量5 μL，乙腈-0.4%磷酸溶液（25∶75）為流動相，檢測波長為277 nm。

②對照品、供試品溶液及陰性對照品溶液的制備。牛蒡苷對照品溶液的制備：精密稱取牛蒡苷對照品，加甲醇制成濃度為0.3110 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取銀翹口服液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超聲30 min，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

陰性對照品溶液的制備：按處方制備工藝制成去除牛蒡子的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

③系統適應性試驗。分別吸取牛蒡苷對照品、供試品溶液及陰性對照品溶液各5 μL，按以上所建立的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

④標準曲線制備。取牛蒡苷對照品用50%甲醇分別配制成0.0622、0.1244、0.1866、0.3110、0.4354、0.6220 mg/mL 6個濃度，按建立的色譜條件依次進樣，記錄色譜圖與峰面積，以峰面積對牛蒡苷的濃度進行線性回歸。

⑤精密度試驗。將對照品溶液進樣5 μL，重復進樣測定6次，記錄色譜圖與峰面積，考察儀器的測定結果重現性。

⑥重復性試驗。將同一批號的樣品，按供試品溶液制備方法，平行制備成6份供試品溶液，按建立的色譜條件分別進行測定，記錄色譜圖與峰面積。

⑦穩定性試驗。吸取供試品溶液，按建立的色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進行試驗測定，記錄色譜圖與峰面積。

⑧加樣回收率試驗。平行精密量取配制好的供試品溶液1 mL（牛蒡苷含量0.6725 mg/mL），共6份，分別置50 mL量瓶中，分別加入0.3110 mg/mL對照品溶液2 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。按照建立的色譜條件進行試驗，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積計算，測定牛蒡苷含量，計算回收率。

回收率（%）=（測得牛蒡苷的量-制劑中牛蒡苷原有量）/加入牛蒡苷對照品的量×100

⑨樣品牛蒡苷含量測定。選取10批樣品，按照建立的色譜條件進行試驗，記錄色譜圖和峰面積，計算出樣品中牛蒡苷的含量。

2結果與分析

2.1薄層鑒別結果

2.1.1金銀花的薄層鑒別由圖1可知，供試品色譜中，在與對照品綠原酸色譜和金銀花對照藥材色譜相應的位置上有顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照液色譜中無相應熒光斑點。

2.1.2連翹的薄層鑒別由圖2可知，供試品色譜中，在與對照品連翹苷色譜和連翹對照藥材色譜相應的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應斑點。

2.1.3牛蒡子的薄層鑒別由圖3可知，供試品色譜中，在與對照品牛蒡苷色譜和對照藥材色譜相應的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應斑點。

2.1.4荊芥的薄層鑒別由圖4可知，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應斑點。

2.1.5薄荷的薄層鑒別由圖5可知，供試品色譜中，在與薄荷腦對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應的斑點。

2.2牛蒡苷含量測定結果

2.2.1系統適應性試驗圖6顯示，銀翹口服液樣品色譜圖中，在與牛蒡苷對照品色譜圖的相應位置上有相同保留時間的色譜峰，在此保留時間，陰性對照液無色譜峰出現。樣品色譜中牛蒡苷峰與相鄰峰分離良好，陰性對照溶液中所含成分對牛蒡苷測定無干擾作用。

2.2.2牛蒡苷線性關系考察不同濃度的對照品溶液峰面積結果見表1。

以牛蒡苷濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制牛蒡苷標準曲線，見圖7。將表1中的數據進行線性回歸，得到線性回歸方程：y=2684.3x-0.3691（R2=1.0000）。結果表明，牛蒡苷進樣量在0.0622～0.6220 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2.3精密度試驗結果見表2，RSD為0.27%，表明本方法精密度良好。

2.2.5穩定性試驗結果見表4，RSD為1.85%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.6加樣回收率試驗結果見表5，平均回收率為102.4%，RSD為2.2%，表明該方法準確可信。

2.2.7樣品牛蒡苷含量測定10批樣品的含量測定結果見表6，牛蒡苷平均含量為6.7246 mg/mL。

3討論

3.1薄層色譜法（TLC）是一種快速、靈敏、高效地分離和定性分析微量物質的方法，因其設備簡單、操作方便、專屬性好、分析速度快等特點，已成為中藥質量控制的主要手段之一[6，7]。本研究對新研發的銀翹口服液中每味中藥的有效成分進行薄層定性鑒別，目的是檢出其藥味成分。經過反復測定，發現口服液中金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、荊芥有效成分在薄層鑒別中色譜明顯、重復性好、專屬性強、無干擾，說明該方法可快速確定銀翹口服液中以上五味中藥的存在，因此可將其用于銀翹口服液質量標準草案鑒別項。

3.2影響薄層鑒別的因素較多，主要包括樣品處理、薄層板、點樣量、展開劑、顯色劑等，可直接影響到色譜圖中斑點分離度、清晰度和重現性[8]。如點樣量太小，斑點不清晰；點樣量太多，展開劑不能全部負載，容易產生脫尾現象。供試液中雜質成分較多，由于相互干擾或背景污染難以得到滿意的分離效果。對于難以分離的相鄰物質，根據它們的理化性質，選用極性大小適宜的溶劑并做好配比則最為關鍵[9，10]。本試驗分別對樣品處理、薄層板、點樣量、展開劑、顯色劑等影響薄層色譜的因素進行了反復篩選和優化，最終確定了最佳的薄層色譜條件。

3.3處方中牛蒡子疏散風熱、解毒利咽，其主要活性成分牛蒡苷是重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒等作用，其分子式、結構式明確，因此將牛蒡苷確定為本品含量測定的指標成分。本研究所建立的高效液相色譜含量測定方法精確性、穩定性、重復性良好，可快速準確地測定出牛蒡苷的含量。上述鑒別和含量測定方法可用于銀翹口服液質量標準和制劑質量的有效檢測和控制。

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