馬凡綜合征一家系的致病基因篩查

夏文佼，鞏　雪，高　紅，肖　偉

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·臨床報告·

馬凡綜合征一家系的致病基因篩查

夏文佼1，鞏雪1，高紅2，肖偉1

Citation:Xia WJ, Gong X, Gao H,etal. Gene screening in a Chinese family with Marfan syndrome.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):948-951

摘要

目的：對中國遼寧省一個具有常染色體顯性遺傳特點的馬凡綜合征(Marfan syndrome,MFS)家系進行突變基因的篩查。

方法：分別采集家系成員的外周靜脈血，提取基因組DNA，通過對與馬凡綜合征相關的致病基因進行遺傳學研究和分析，選取候選基因并設計引物，應用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段后進行瓊脂糖凝膠電泳分離，利用直接測序法確定致病基因及其突變位點。

結果：該家系遺傳方式符合常染色體顯性遺傳，先證者表型為雙眼晶狀體向鼻上方脫位，通過對候選基因外顯子直接測序，發現該家系內患者原纖維蛋白基因-1(fibrillin-1 gene，FBN1)第7個外顯子第640位堿基有1個A>G的點突變，此突變導致蛋白第214位的甘氨酸被絲氨酸取代(G214S)。

結論：FBN1基因 c．A640G(p.G214S)突變為該馬凡綜合征家系的致病因素。

關鍵詞：馬凡綜合征；FBN1基因；突變

引用：夏文佼，鞏雪，高紅，等.馬凡綜合征一家系的致病基因篩查.國際眼科雜志2016;16(5):948-951

0引言

馬凡綜合征(Marfan syndrome,MFS)是一種常染色體顯性遺傳病，發病率為 1/10000～1/20000，以眼部、骨骼及心血管先天發育異常為主要特征[1]。典型眼部異常表現為先天性晶狀體脫位進行性加重, 晶狀體向上方移位為主，常造成難以矯正的屈光不正或合并弱視，部分患者伴虹膜角膜角異常、脈絡膜及黃斑缺損，因此繼發青光眼或視網膜脫離等。典型骨骼異常表現為頭長臉長、四肢骨骼細長。典型心血管異常表現為心臟卵圓孔未閉、動脈瘤或主動脈發育異常等。目前原纖維蛋白-1基因(fibrillin-1 gene,FBN1)基因突變是導致MFS的重要原因已經得到科學界的廣泛認可[2-3]，文獻顯示幾乎90% MFS是由FBN1基因突變引起的，其中大多數為錯義突變且為某一MFS家系所特有，只有10%突變可見于不同家系中。FBN1基因主要負責編碼糖蛋白原纖維蛋白-1 (fibrillin-1，Fib-1)，是構成細胞外微纖維的主要蛋白之一，晶狀體懸韌帶主要由其構成。1991年，Dietz等[4]在MFS患者的FBN1基因中發現了R239P和 C1409S兩種突變，并首次提出 FBN1基因突變是MFS的致病原因。先天性晶狀體脫位作為MFS主要表現之一，與FBN1基因突變有著密不可分的關系，研究顯示FBN1基因突變主要存在于MFS患者及先天性單純性晶狀體脫位患者中。先天性單純性晶狀體脫位發病率為6/10萬[3]，在臨床表現上和基因學上均與MFS有重疊性。FBN1突變已經被Ghent標準作為MFS診斷的主要指標之一[5]，MFS表現型和基因型均有異質性而且其臨床表現差異很大,非典型MFS表現為晶狀體脫位及輕微骨骼異常，無典型心血管異常，雖無法完全滿足臨床診斷標準，但經過進一步學術研究發現隨著時間進展非典型MFS也可逐漸出現典型心血管異常改變且文獻證實非典型MFS家系與典型MFS家系可存在相同的基因突變位點[6]。2010年用于診斷MFS的Ghent標準得到更新，稱該種晶狀體脫位患者合并輕微的骨關節異常和(或)主動脈根部擴張情況為原纖維蛋白病(Fibrillinopathy)[7-10]。迄今為止，已發現與馬凡綜合征的發生相關的基因除FBN1基因外還有：轉化生長因子-β2(transforming growth factor-β2,TGFβ2)基因[11]、 轉化生長因子-β3(transforming growth factor-β3,TGFβ3)基因[12]、轉化生長因子-βⅠ型受體(transforming growth factor-βreceptor typeⅠ，TGFβR1)基因、轉化生長因子-βⅡ型受體(transforming growth factor-β receptor typeⅡ，TGFβR2)基因等[13-15]。我們對遼寧省丹東市的一個四代常染色體顯性遺傳馬凡綜合征家系進行相關基因突變位點的篩查結果，報告如下。

1對象和方法

1.1對象對遼寧省丹東市的一個四代常染色體顯性遺傳馬凡綜合征家系進行相關基因突變位點的篩查。 因先證者就診于中國醫科大學附屬盛京醫院眼科而被發現，獲中國醫科大學倫理委員會批準且參與本次研究的家系成員均知情同意后(先證者系未成年，其監護人均知情同意)，對家系成員進行病史采集，散瞳后進行雙眼眼前節、眼底相關檢查及心臟彩超等檢查，并進行眼部及手部圖像采集。利用GenoPro軟件進行該家系系譜圖的繪制，確定其遺傳方式為常染色體顯性遺傳，結合家系成員的眼部表現、骨骼表現及心臟彩超結果，確定該家系類型為馬凡綜合征家系。家系成員均非近親結婚且患者母親妊娠期無異常。本試驗遵守赫爾辛基宣言，通過倫理委員會審批，且參與本次研究的家系成員均簽署知情同意書。該家系共11人，其中患者5例(Ⅰ1、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅲ4、Ⅳ2)均有先天性雙眼晶狀體向鼻上方脫位表現，無眼部其他異常，患者手指較正常人細長，其中Ⅲ2及Ⅲ4有主動脈擴張,Ⅱ2死于主動脈瘤破裂，其余正常家系成員均無眼部、骨骼及心血管異常，見圖1～5。

1.2方法

1.2.1主要試劑QIAGEN DNA全血抽提試劑盒：購自大連寶生物TaKaRa基因公司；Taq DNA 聚合酶：購自大連寶生物TaKaRa公司；限制性內切酶(RsaI及相關Buffer)：購自大連寶生物TaKaRa公司；dNTP：購自上海生工生物工程有限公司；DNA marker：購自大連寶生物TaKaRa公司 ；異戊醇：購自國藥集團化學試劑有限公司；乙酸：購自國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇：購自國藥集團化學試劑有限公司；Tris：購自國藥集團化學試劑有限公司；Na2EDTA·2H2O：購自國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖：購自國藥集團化學試劑有限公司；溴乙錠：購自上海博亞生物工程有限公司；引物合成：由北京美吉生物有限公司及上海生工生物工程有限公司合成。

圖1馬凡綜合征家系系譜圖□：正常男性：○：正常女性；■：患病男性；●：患病女性；↖：先證者。

圖2患者Ⅳ2雙眼眼前節照相A:右眼；B:左眼。

圖3患者Ⅲ4雙眼眼前節照相A:右眼；B:左眼。

圖4A:家系中患者Ⅲ4雙手；B:正常人雙手。

圖5患者Ⅲ4心臟彩超結果：升主動脈內徑增寬(50mm)。

1.2.2主要儀器制冰機(SANYO)、-20℃冰箱(Siemens)、震蕩恒溫培養箱(ZHYW-1102C)、高速低溫離心機(Eppendorf 5417R)、臺式冷凍離心機(Eppendorf 5148R)、渦旋振蕩器(Scientific industries)、PCR儀(Biometra T1)、電泳儀(200/2.0，Bio-Rad)、DYCP-31D型水平式凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊(北京市六一儀器廠)、超凈工作臺(北京亞泰克隆)、凝膠成像分析系統(3500，天能)、生物安全柜(Thermal Scientific)、電子天平(AB135-S Mettler Toledo)、微波爐(Panasonic)、精密電子天平(MXX-212)(DENVER INSTRUMENT)、紫外分光光度計(Nanodrop,Thermal Scientific)、高壓滅菌設備Autoclave HVE-50 (Hyrayama)、微量移液器(吉爾森)、各種規格移液器吸頭及EP管，無菌手套等。

1.2.3采集全血標本抽取每位參與本次研究的家系成員外周靜脈血 2mL，利用EDTA(乙二胺四乙酸二鈉，EDTA2Na2K·H2O)抗凝后保存于冰箱-20℃，用于提取基因組DNA。

1.2.4利用QIAGEN DNA 全血抽提試劑盒進行DNA提取步驟(1)取200μL全血樣本于 1.5mL 離心管中;(2)加入20μL蛋白酶protease;(3)加入Buffer AL 200μL并進行渦旋振蕩，時間為15s;(4)恒溫56℃加熱，持續時間為10min;(4)利用臺式離心機進行快速離心(5)向離心管中加入200μL無水乙醇;(5)轉移至2mL收集管后以8000r/min轉速離心，時間為1min;(6)將吸附柱轉移至新2mL接收管并丟棄舊收集管;(7)加入500μL Buffer AW1，并進行離心，轉速8000r/min,時間為1min;(8)再次將吸附柱轉移至新2mL接收管并丟棄濾液;(9)加入500μL Buffer AW2，并進行離心，轉速14000r/min,時間為3min;(10)將吸附柱轉移至新2mL收集管并快速離心1min;(11)將吸附柱轉移至新1.5mL收集管，加入200μL雙蒸水即可。

1.2.5 DNA濃度測定利用紫外分光光度計測定 DNA 溶液 OD 值并初步計算所提取的 DNA 的純度和濃度， DNA OD260/OD280 比值均達到 1.5～1.8可進行下一步實驗操作。

1.2.6選取候選基因檢索孟德爾人類遺傳數據庫(OMIM)，根據表型首先選取候選基因為FBN1基因。

1.2.7根據候選基因設計引物用Primer6軟件設計引物序列，由上海生工生物有限公司合成，見表1。

1.2.8目的基因片段擴增以家系成員基因組DNA為模板，應用PCR技術擴增候選基因外顯子及側翼內含子序列：25μL反應體系中含有DNA 1μL正向引物1μL，反向引物 1μL，LATaq聚合酶12.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反應條件：98℃預變性1min；98℃變性10s，55℃退火30s， 72℃延伸1min，循環35次，72℃退火5min。

1.2.9電泳檢測PCR產物PCR擴增產物在 15g/L瓊脂糖凝膠上120V恒壓電泳20～30min，分離并確定目的片段。

1.2.10測序分析對所得PCR產物分別進行Sanger測序，測序結果通過Chromas軟件進行分析，與 UCSC基因組序列進行參照比對，檢測突變位點。

2結果

通過對該馬凡綜合征家系全部患者 FBN1 基因的第7個外顯子核苷酸序列第640位的腺嘌呤均被鳥嘌呤替代(A640G), 密碼子由GGC變成 AGC，編碼的氨基酸由甘氨酸變為絲氨酸(G214S)，而家系中的正常人無該突變，將突變位點與核苷酸多態性(SNP)數據庫進行比對，排除位于側翼內含子的突變及外顯子中非致病突變(如同義突變等)，證明該突變與該家系的先天性晶狀體脫位發病有關[16]，見圖6。

表1該家系FBN1基因部分外顯子PCR引物序列

基因(外顯子)正向引物(5-3)反向引物(5-3)FBN1-1GGAATTAGAGGCCAAACAGAGAGCCTCTTGTAAAATACAGCCFBN1-2AACCGCTACTCCACCTCTTCCTGCAACACAGAGACAAATCCCFBN1-3CCGATGCCCTGAAAGTCTCCCACTTTCCTCTAGAAACAACCAFBN1-4TAGTGTCCCAAGCTACCAACCAGACCAAGTTGATGTATTTCCCFBN1-5TGATGGATTGAGTGCTGTGGAAATGAGAGGCCAGATGAAGGAFBN1-6CTCAATTAGGTCATTATCAGGGGCAAGCAAGGTGGTGAAGGFBN1-7AGATGCTTCACGGAATGAGACGAGCTTAATCCTTACCCTTAC

圖6A：患者(Ⅳ2)測序圖；B：正常人(Ⅲ5)測序圖。

3討論

FBN1基因(MIM:134797)定位于 15q21.1，主要負責編碼糖蛋白原纖維蛋白-1，該蛋白聚合后平行排列形成微纖維骨架，參與彈性蛋白前體的沉積和彈性纖維的形成, 晶狀體懸韌帶即主要由其構成[17]。1991年Dietz等[4]應用原位雜交技術定位和克隆出FBN1基因并提出該基因的突變可導致MFS。 FBN1基因具有較高的突變率,目前報道FBN1基因有1800余種突變和MFS有關，其中大部分為錯義突變，幾乎占突變總數的三分之二[18]。且該基因的致病突變常發生在第2、15、22、27、46、55或62個外顯子，幾乎不發生于外顯子7、外顯子41及外顯子65[19-20]。

通過對外顯子直接測序法，我們發現了中國遼寧省一個馬凡綜合征家系位于FBN1基因第640位堿基的錯義突變，由腺嘌呤轉換為鳥嘌呤(A>G)，因此導致蛋白翻譯產物由甘氨酸變成了絲氨酸 (G214S), 阻斷正常微纖維聚合，產生異常蛋白及顯性負效應，同時，異常蛋白對蛋白水解酶敏感性增加，細胞外基質微纖維結構裂解，彈性纖維的穩定性下降，結締組織的結構功能受到嚴重影響，由此導致馬凡綜合征各系統異常的發生。本次研究發現的突變位點(c.640 A>G)比較罕見，于2012年首次被發現[16]，但與本次試驗研究對象不同的是其家系患者心血管異常表現不典型，雖然其患者均有雙眼晶狀體脫位及骨骼異常，但遺憾的是無任何相關表型圖片，且對于眼部描述不詳盡，未說明患者晶狀體脫位方向及程度，我們無法進行進一步對照及深入研究，雖然基因突變位點相同，但最終產生的表型不盡相同，這也恰恰是對基因表達多效性的一種合理詮釋。

FBN1指導合成的原纖維蛋白-1的前體含有一些特異結構區, 如類表皮樣生長因子(epidermal growth factor, EGF)區、鈣結合同源序列 (calcium binding consensus sequence epidermal growth factor, cbEGF) 區及轉化生長因子β結合蛋白(transforming growth factor β1 binding protein，TB)等。EGF區高度保守的半胱氨酸殘基可與其他氨基酸之間形成二硫鍵，原纖維蛋白分子也可與鈣結合保持伸展棒狀,避免被蛋白酶分解。cbEGF 區與TB區結構雜交形成Fib 區，維持結構穩定性。原纖維蛋白的氨基端有一富含脯氨酸的中樞區域,參與合成原纖維蛋白二聚體，保證微纖維線性長度，二聚體進一步聚合形成微纖維。正常形態和功能的微纖維可為非彈性組織提供附著點,從而維持和調節結締組織的彈性及韌性。大多數FBN1突變發生在FGF結構域，本家系的錯義突變位于FBN1基因第640位堿基A>G，經堿基替換后其翻譯產物由甘氨酸變成了絲氨酸, 氨基端的第1個 Fib 區極性發生變化[3],阻斷微纖維聚合、影響高級結構的形成，產生異常蛋白，造成野生株單倍劑量不足同時干擾野生型蛋白的功能，產生顯性負效應[21]。同時，異常蛋白對蛋白水解酶敏感性增加，細胞外基質微纖維結構裂解，彈性纖維的穩定性下降，結締組織產生異常改變[22-23]。通過免疫定位技術檢測FBN1基因突變患者的晶狀體懸韌帶及囊膜，可發現其纖維蛋白數量與分布不同程度減少并出現斷裂和片段化，尤其是懸韌帶連接位點，微纖維排列疏松,失去正常周期帶及串珠形態且串珠間區域界限不清[24]，彈性遠差于正常晶狀體懸韌帶，易斷裂。從而進一步明確了FBN1基因突變與晶狀體懸韌帶先天性發育不良及先天性晶狀體脫位等疾病的關系[25]。

伴隨著基因組學的發展、PCR技術、連鎖分析、基因敲除等技術得到了試驗者的熟練應用，通過掌握和應用基因系譜分析、基因直接測序、全基因組測序及高通量測序技術全外顯子測序等研究方法，我們對馬凡綜合征的研究日趨深入。根據家系具體情況制定相應研究計劃，本次研究對象為四代小家系，因此采用既快捷又經濟的候選基因外顯子測序法。利用現有豐富的遺傳資源，發現與馬凡綜合征相關的致病基因突變，深入研究其致病機制，不僅對患病家系意義重大，更可豐富人類疾病的致病基因庫，為該類家族性疾病的分子診斷和產前預測提供科學理論依據及臨床指導，減少先天性疾病患兒的出生率，提高人口質量。

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Gene screening in a Chinese family with Marfan syndrome

Wen-Jiao Xia1, Xue Gong1, Hong Gao2, Wei Xiao1

Foundation item:National Natural Science Foundation of China (No.30973276)

1Department of Ophthalmology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，Liaoning Province，China;2Central Laboratory of Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，Liaoning Province，China

Correspondence to:Wei Xiao. Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，Liaoning Province，China.xiaow@ sj-hospital.org

Received：2016-02-18Accepted：2016-04-13

Abstract

?AIM:To analyze the causative gene mutation for Marfan syndrome (MFS) with autosomal dominant hereditary in a Chinese family in Liaoning Province，China.

?METHODS: Venous blood was collected and candidate gene was selected to design primers according to the clinical phenotype. With genomic polymerase chain reaction(PCR) performed, the coding exons and their flanking intron in sequences of candidate gene were sequenced,DNA fragments separated by agarose gel electrophoresis and direct sequencing method was used to determine the pathogenic gene.

?RESULTS:Phenotype of the proband was presented as ectopic lentis. Sequencing of the coding regions of FBN1 gene showed the presence of a heterozygous A→G transversion at nucleotide 640 in the 7 exon of FBN1 and the missense mutation made for Glycine into Serine(G214S).

?CONCLUSION:A heterozygous mutation of FBN1 c．A640G(p.G214S)is responsible for the Marfan syndrome in the four generation Chinese pedigree.

KEYWORDS:?Marfan syndrome;FBN1 gene;mutation

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.40

收稿日期：2016-02-18 修回日期： 2016-04-13

通訊作者：肖偉，博士，教授，博士研究生導師,研究方向:遺傳性白內障基因突變篩查及兒童白內障手術治療.xiaow@ sj-hospital.org

作者簡介：夏文佼，在讀碩士研究生，研究方向:白內障。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.30973276)
作者單位：
1(110004)中國遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬盛京醫院眼科;
2(110004)中國遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬盛京醫院中心實驗室