B7-H1在肝癌中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

黎　靖　陳　紅　雷正明　付文廣　淦　宇　蔣　禹　溫　劍　李　秋　李　波

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川　瀘州　646000)

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B7-H1在肝癌中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

黎靖陳紅雷正明付文廣淦宇蔣禹溫劍李秋李波

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000)

〔摘要〕目的探討B(tài)7-H1在人肝癌組織中的表達(dá)情況及其對肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力和凋亡水平的影響。方法采用組織化學(xué)染色方法觀察肝癌組織和癌旁正常組織中B7-H1的表達(dá)情況。采用Lonza電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2進(jìn)入肝癌HepG2細(xì)胞，并通過RT-PCR和Weatern印跡方法檢測肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1的表達(dá)情況。敲低肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1的表達(dá)后，采用MTT方法檢測肝癌HepG2細(xì)胞的增殖情況，并采用Annexin V/7-AAD雙染的方法檢測肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果與癌旁正常組織相比，肝癌組織中B7-H1的表達(dá)水平顯著升高。采用Lonza電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2進(jìn)入肝癌HepG2細(xì)胞后，肝癌HepG2細(xì)胞中-B7-H1的表達(dá)水平均顯著降低。轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1表達(dá)后，肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力均顯著降低，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1表達(dá)后，肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡均顯著升高，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。結(jié)論肝癌組織中B7-H1的表達(dá)水平顯著升高，且B7-H1可促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力，并抑制肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡水平，提示肝癌組織中高表達(dá)的B7-H1與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕肝癌；B7-H1；增殖；凋亡

B7-H1(B7 homolog 1)是B7家族的第三個(gè)成員，又稱為程序性死亡配體(PD-L1)。B7-H1主要表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞〔1，2〕。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的功能，且在多種腫瘤細(xì)胞均存在B7-H1不同程度的表達(dá)上調(diào)〔3，4〕。而關(guān)于B7-H1在肝癌組織的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響目前研究還不是很多，本研究旨在觀察B7-H1對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1臨床資料選取2013 年12月1日至2014 年12月01日在我科住院并行手術(shù)治療的肝癌患者50例。患者術(shù)前均未接受化學(xué)治療、放射治療或免疫治療，收取患者癌組織標(biāo)本，同時(shí)收集50例患者癌旁組織標(biāo)本作為對照。組織標(biāo)本離體后10 min內(nèi)凍存于液氮中保存。每例樣本均經(jīng)過組織病理學(xué)診斷證實(shí)為肝癌，癌旁組織亦均經(jīng)過組織病理學(xué)診斷證實(shí)未見腫瘤進(jìn)入。患者的平均年齡(58.1±17.1)歲。

1.2細(xì)胞及主要試劑人肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG及免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購自Lonza公司；si-B7-H1-1和si-B7-H1-2購自Invitrogen公司；B7-H1和Actin抗體購自Santa Cruz公司；Annexin V/7-AAD染色試劑盒購自Biolegend公司。

1.3免疫組織化學(xué)染色方法標(biāo)本采用甲醛固定、石蠟包埋的組織進(jìn)行，具體操作方法參見文獻(xiàn)報(bào)道〔5〕。

1.4電穿孔轉(zhuǎn)染法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5Western印跡肝癌HepG2細(xì)胞總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，通過半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜隨后采用含5% BSA 的TBST室溫孵育封閉2 h，于適量封閉液加入鼠抗人p-Smad2和p-Erk1/2抗體，4℃過夜孵育。次日以0.1% TBST 洗滌硝酸纖維素膜3次，5 min/次，加入相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 子弟硝酸纖維素膜后，采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進(jìn)行顯色。β-actin作為內(nèi)參對照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6MTT方法檢測細(xì)胞增殖能力肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150 μl的DMSO溶液，低速震蕩10 min后，波長490 nm處測定OD值。

1.7凋亡染色方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1B7-H1在肝癌組織中的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，癌旁正常組織僅6例(12.0%)為B7-H1染色陽性；而肝癌組織有24例(48.0%)。肝癌組織B7-H1表達(dá)水平與癌旁正常組織相比顯著升高。見圖1。

圖1　肝癌組織B7-H1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×100)

2.2B7-H1在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2可顯著降低肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1的mRNA表達(dá)水平(分別為0.38±0.06，0.48±0.09)，parental組為1.00±0.39，si-control組為1.14±0.43；同時(shí)，轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2亦可顯著降低肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1的蛋白表達(dá)水平。見圖2。

圖2　敲低B7-H1在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)效果檢測

2.3B7-H1對肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力的影響如圖3所示，轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1表達(dá)后，肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力均顯著降低，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。

2.4B7-H1對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡水平的影響轉(zhuǎn)染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2細(xì)胞中B7-H1表達(dá)后，肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡均顯著升高〔分別為(14.13±4.13)%，(13.65±3.87)%〕，與對照組〔parental組為(6.94±1.86)%，si-control組為(7.08±1.74)%〕相比差異顯著(P<0.01)。

圖3　B7-H1對肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

3討論

免疫共刺激分子B7-H1(又稱為CD274)是新近發(fā)現(xiàn)的程序性死亡共抑制受體(PD-1)(又稱為CD279)的配體分子〔6〕。細(xì)胞被激活或在有IFN-α存在的條件下，B7-H1的表達(dá)可出現(xiàn)上調(diào)。除外表達(dá)于淋巴細(xì)胞，在心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰島和胎盤組織中也檢測到低水平的B7-H1表達(dá)〔7〕。正常情況下，表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞表面的B7-H1可通過于T細(xì)胞表面的PD-1相結(jié)合，而在誘導(dǎo)和維持免疫耐受中發(fā)揮重要作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1分子不僅表達(dá)于淋巴細(xì)胞和正常組織中，在惡性腫瘤中也有表達(dá)，包括肺、食道、頭頸部鱗癌以及其他類型的腫瘤，如乳腺癌、黑素瘤、膠質(zhì)瘤、卵巢癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌〔8〕。腫瘤組織中表達(dá)的B7-H1分子與腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)，且與腫瘤惡性程度相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阻斷B7-H1的作用可加速腫瘤的消退〔9，10〕。腫瘤相關(guān)的B7-H1具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)凋亡的作用，從而使得腫瘤科從T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視作用中逃逸〔11〕。關(guān)于B7-H1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究還處于初期階段。Dong等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，在正常的結(jié)腸組織中不存在B7-H1的表達(dá)，而在惡性程度較高的結(jié)直腸癌組織中可檢測到B7-H1的表達(dá)。同時(shí)，Shi等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)B7-H1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后不良密切相關(guān)，同時(shí)具有調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的功能。

本研究結(jié)果顯示，在肝癌組織中B7-H1的表達(dá)水平顯著升高；同時(shí)，B7-H1具有存進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，并抑制肝癌細(xì)胞凋亡的作用，提示肝癌組織中高表達(dá)的B7-H1與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-08-17修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號〕R735

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1832-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.018

基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(140030)

第一作者：黎靖(1970-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事肝膽胰疾病基礎(chǔ)和臨床方向研究。