四君子湯含藥血清抑制甲狀腺癌側群細胞生長的實驗研究

田黎　崔巍　孫紅

四君子湯含藥血清抑制甲狀腺癌側群細胞生長的實驗研究

田黎崔巍孫紅

710000 西安，西安市北方醫院老年科(田黎)；710043 西安，西安交通大學醫學院第一附屬醫院內分泌科(崔巍)，腫瘤科(孫紅)

【摘要】目的評估四君子湯含藥血清對甲狀腺癌細胞株(KMH-2和8305C)生長的抑制作用。方法SD大鼠模型制備四君子湯含藥血清；MTT試驗檢測四君子湯含藥血清對甲狀腺癌細胞株KMH-2和8305C體外增殖的影響；Annexin V/PI雙染法檢測四君子湯含藥血清對KMH-2和8305C細胞凋亡的影響；流式細胞儀技術篩選和鑒定KMH-2和8305C的側群細胞；并采用蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome C和Caspase-3的表達水平變化。結果四君子湯含藥血清顯著抑制KMH-2和8305C細胞增殖和誘導細胞凋亡；KMH-2和8305C細胞中存在一定比例側群細胞(1.45±0.01)%和(1.75±0.01)%，側群細胞中ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達水平較高；四君子湯含藥血清可以上調Bax、下調Bcl-2、促進Cytochrome C釋放，激活Caspase-3介導的細胞凋亡途徑。結論四君子湯含藥血清對甲狀腺癌細胞中側群細胞生長有抑制作用，而且這種抑制作用主要是通過誘導細胞凋亡產生。

【關鍵詞】四君子湯含藥血清; 甲狀腺癌; 側群細胞; 細胞凋亡

目前一些中國傳統醫藥在治療腫瘤上取得令人矚目的療效，得到國際上的認可和接受，如三氧化砷、靛玉紅、苦參堿等[1-3]。四君子湯作為補脾益氣的代表方劑臨床主要應用于消化性胃潰瘍以及脾虛體弱等疾病的治療。近年一些研究發現四君子湯對于多種實體腫瘤具有一定的療效[4]。有研究表明四君子湯能夠有效抑制胃癌細胞株SGC-7901接種于裸鼠形成荷瘤的生長[5]。另有研究顯示四君子湯還可以調控內分泌系統，如機體內血清T3、甲狀腺素(T4)、TSH、下丘腦促甲狀腺激素釋放激素(TRH)的分泌水平[5]。眾所周知，甲狀腺癌發病與TSH、TRH等激素分泌異常具有密切關系[6-7]。目前關于四君子湯在甲狀腺癌治療中的作用尚未見報道，因此本研究檢測四君子湯含藥血清對甲狀腺癌細胞株KMH-2和8305C生長和凋亡的影響，希望為甲狀腺癌輔助治療提供一種新的治療策略。

材料與方法

一、藥物制備

四君子湯含藥血清采用SD大鼠模型提取，先將四君子湯熬制成湯劑，詳細步驟參考文獻[8]。24只SD大鼠常規飼養于SPF級動物房，隨機分為4組：生理鹽水組和四君子湯低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各6只。實驗組動物按等體積藥物灌胃，生理鹽水組采用生理鹽水灌胃，連續灌胃3 d，末次灌胃后1 h，乙醚麻醉后無菌腹主動脈采血，分離血清，-20℃保存備用。四君子湯用藥劑量按公式計算：大鼠每日用藥量(g/kg) =人日用劑量×0.007/1.5，即為中劑量組；高劑量組為中劑量組的2倍；低劑量組為中劑量組的1/2。

二、細胞培養

KMH-2和8305C細胞購自中科院細胞研究所。2種細胞均采用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養基培養于37℃、5%CO2、95%濕度條件下的培養箱中。在細胞增殖至80%融合率時傳代。

三、MTT試驗

取5×103對數生長期細胞接種于96孔板過夜，分別采用10%和20%四君子湯含藥血清(低、中、高劑量組)處理。72 h后加MTT溶液(5 g/L)20 μl繼續孵育4 h，每孔加DMSO 100 μl，避光振蕩10 min充分溶解。選擇490 nm波長測定各孔吸光值 (A值)。細胞生長抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

四、細胞凋亡檢測

收集經10%和20%四君子湯含藥血清(高劑量組)處理48 h的至少1×106個細胞，分別進行Annexin V-FITC和PI染色，在室溫靜置15 min后進行流式細胞儀檢測。

五、側群細胞分選和鑒定

將細胞分成對照組和維拉帕米組，收集1×106個細胞加入5 μg/ml Hoechst 33342，維拉帕米組同時加入100 μg/ml維拉帕米，避光37℃孵育70 min，離心后棄上清液用2%的胎牛血清的PBS重懸，再加入終濃度1 μg/ml的PI染色。流式細胞儀檢測分選，350 nm(375)波長紫外光激發Hoechst染色，于450/20 nm帶通下收集測定藍光，675 nm帶通下收集測定紅光。通過蛋白免疫印跡法檢測細胞內ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達水平以分子鑒定。

六、蛋白免疫印跡法

含藥血清處理48 h后，提取細胞總蛋白，采用Bradford法定量，取25 μg蛋白樣本分別經電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光、顯影、定影等過程對蛋白含量進行檢測。Cox IV和β-actin蛋白分別作為線粒體和胞漿蛋白內參照。

七、統計學處理

結果

一、低、中、高劑量組含藥血清對KMH-2和8305C細胞增殖影響的比較

MTT結果顯示(圖1)，10%和20%(中、高劑量組)含藥血清可以抑制KMH-2和8305C細胞增殖(F=4.521,P=0.013)，而低劑量和生理鹽水組含藥血清對KMH-2和8305C細胞增殖并無顯著抑制。

二、低、中、高劑量組含藥血清對KMH-2和8305C細胞凋亡影響的比較

Annexin V/PI試驗結果顯示(圖2)，在10%和20%中、高劑量組含藥血清處理48 h后，KMH-2和8305C細胞凋亡比例顯著高于生理鹽水組(F=8.965,P=0.005)；其他處理組則未出現顯著的細胞凋亡。

三、KMH-2和8305C中側群細胞篩選和鑒定

Hoechst 33342染色顯示(圖3)，KMH-2和8305C細胞中均存在一定比例的側群細胞，比例分別為(1.45±0.01)%和(1.75±0.01)%；當采用維拉帕米處理后，兩種細胞中側群細胞比例明顯下降，分別為(0.48±0.00)%和(0.50±0.01)%。蛋白免疫印跡結果顯示側群細胞的腫瘤干細胞標志物ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達顯著高于非側群細胞。

圖1　中、高劑量四君子湯灌胃組含藥血清抑制兩種細胞增殖

A：各劑量組含藥血清對KMH-2細胞增殖的影響；B：各劑量組含藥血清對8305C細胞增殖的影響

圖2　中、高劑量四君子湯灌胃組含藥血清誘導兩種細胞凋亡

A：流式細胞儀凋亡分析圖，左下象限代表活細胞、右下象限代表早期凋亡細胞、右上象限代表晚期凋亡細胞、壞死細胞；B和C：各劑量組含藥血清對KMH-2和8305C細胞凋亡的影響

四、四君子湯抑制側群細胞增殖及誘導側群細胞凋亡

MTT實驗結果顯示(圖4)，20%高劑量灌胃組含藥血清可以抑制KMH-2和8305C細胞中側群細胞增殖，而其他處理組并不能抑制側群細胞增殖。凋亡實驗結果顯示，20%高劑量灌胃組含藥血清誘導KMH-2和8305C細胞中側群細胞凋亡，而其他處理組則并未出現細胞凋亡。

圖3　側群細胞篩選和鑒定

A：利用流式細胞儀檢測Hoechst 33342熒光，篩選側群細胞，圖中小框中所示即為側群細胞；B：兩種細胞中側群細胞比例以及維拉帕米對側群細胞比例的影響；C：腫瘤干細胞標志物ALDH、CD44和ABCG2蛋白在側群和非側群細胞的表達水平

五、四君子湯激活側群細胞內源性凋亡途徑

蛋白免疫印跡結果顯示(圖5)，20%四君子湯高劑量組含藥血清處理48 h后， 側群細胞內bax蛋白表達顯著上調，而Bcl-2蛋白表達顯著下降，胞漿內Cytochrome C含量增高，另外可檢測到Caspase-3的活性片段，說明內源性凋亡途徑被激活。

討論

在晚期甲狀腺癌治療的臨床實踐中，面對臨床常用化療藥物較嚴重的毒副作用，人們更加迫切地希望找到治療甲狀腺癌的新方法。現代研究發現，四君子湯治療中晚期惡性腫瘤，不僅能抑制腫瘤細胞生長，而且能增強機體的免疫力，改善癥狀，延長生存期，提高生活質量。四君子湯由4種天然植物熬制而成，其有效活性成分非常復雜難以明確，這也是許多在臨床上被證明有效的中國傳統醫藥無法獲得國際認可的重要原因。在本研究中，我們采用血清藥物學方法提取更適用于體外細胞實驗的四君子湯含藥血清，含藥血清比湯劑成分更純凈，不會存在過多影響細胞生物學行為的雜質[9]。

圖4　20%高劑量灌胃組含藥血清抑制側群細胞增殖、誘導側群細胞凋亡

A、B：各劑量組含藥血清對側群細胞增殖的影響；C、D ：Annexin V/PI試驗(20%高劑量組含藥血清處理組，其余處理組未顯示)；E、F：各劑量組含藥血清對側群細胞凋亡的影響

通過MTT實驗證實四君子湯含藥血清能夠抑制KMH-2和8305C細胞增殖，然后通過流式細胞儀技術對KMH-2和8305C細胞中的側群細胞進行篩選和鑒定。腫瘤干細胞學說認為腫瘤組織中存在極少量的腫瘤干細胞，它們具有自我更新和無限增殖能力，與其他腫瘤細胞相比，它們具有更強的成瘤性、轉移性和抗藥性，腫瘤之所以難以消滅，手術后易復發，都是因為常規治療方法并未徹底殺死腫瘤干細胞。側群細胞被認為是一群具有腫瘤干細胞特征的細胞，它們可以表達豐富的藥物轉運蛋白，能夠迅速泵出熒光染料Hoechst[10]。通過流式細胞儀技術人們相繼在肺癌、肝癌、胰腺癌和結腸癌等腫瘤中發現側群細胞[11-14]。甲狀腺癌組織中也存在側群細胞，并且認為ALDH、CD44和ABCG2是甲狀腺癌SP細胞的標記物[15-16]。在本研究中我們也發現KMH-2和8305C細胞株中存在一定比例側群細胞，并且這部分細胞中ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達水平顯著高于其他腫瘤細胞，進一步證明它們是側群細胞。通過MTT實驗和凋亡實驗，我們發現四君子湯能顯著地抑制側群細胞生長，誘導側群細胞凋亡。細胞凋亡過程涉及一系列基因調控和信號通路，例如線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑以及內質網凋亡途徑等[17-18]。在本研究中我們發現四君子湯含藥血清可以誘導Bax/Bcl-2比例增加，促進Cytochrome C含量升高，并且激活Caspase-3，因此可以推斷四君子湯是通過激活線粒體凋亡途徑誘導側群細胞凋亡。

圖5　20%四君子湯高劑量組含藥血清對凋亡相關蛋白表達的影響

綜上所述， KMH-2和8305C細胞中存在側群細胞，四君子湯含藥血清能夠通過激活線粒體凋亡途徑誘導側群細胞凋亡，抑制其增殖。在本研究中我們使用四君子湯含藥血清作為刺激物，在后續研究中將利用現代色譜技術設法找到四君子湯中的有效活性分子。

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(本文編輯：楊江瑜)

Study on anti-tumor activities of Sijunzi decoction against growth of side population in thyroid cancer cells

TianLi，CuiWei,SunHong.

DepartmentofGeriatric,NorthHospitalofXi’anCity,Xi’an710000,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the inhibiting effects of Sijunzi decoction (SJZD) on the growth of thyroid cancer cell lines (KMH-2 and 8305c). MethodsThe SJZD-containing serum was obtained by using model of SD rats . The effects of SJZD-containing serum on proliferation of KMH-2 and 8305c cells were examined by using MTT assay. The effects of SJZD-containing serum on apoptosis of KMH-2 and 8305c cells were examined by using Annexin V/PI double staining assay. The side population (SP) of KMH-2 and 8305c cells was screened and identified by Flow cytometry analysis. In addition, the expressions of apoptosis-related proteins including Bax, Bcl-2, Cytochrome C and Caspase-3 were examined by western blot assay. ResultsSJZD-containing serum significantly inhibited the prolifecation of KMH-2 and 8305C cells and induced apoptosis. There existed SP(1.45±0.01)% and (1.75±0.01)% in a certain proportion that in the KMH-2 and 8305c cells, and protein expression level of ALDH, CD44 and ABCG2 in the SP were higher. Further analysis showed that SJZD-containing serum promoted apoptosis of SP cells of KMH-2 and 8305C cells by up-regulating Bax, Cytochrome C and Caspase-3 and down-regulating Bcl-2. ConclusionsOur data revealed the mechanism of the anti-cancer effect of SJZD-containing serum, and this effect was mainly produced through inducing the apoptosis of cells.

【Key words】Sijunzi decoction； Thyroid cancer；Side population； Apoptosis

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.004

通訊作者，田黎，E-mail：tianlihappy1234@sina.com

Corresponding author， Tian Li, E-mail：tianlihappy1234@sina.com

(收稿日期：2015-08-11)

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