HPLC法測定牛奶中甲砜霉素殘留前處理方法的研究

章厲劼 楊強

摘 要：甲砜霉素屬于氯霉素類的抗生素，作為氯霉素的替代藥物在畜牧業養殖業中得到廣泛使用。并在2014年1月，我國頒布了《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素殘留量的測定 高效液相色譜法》食品安全國家標準。但該方法處理樣品時前處理在液液萃取時容易乳化，操作難度大，檢測結果標準偏差較大，精密度低，穩定性差。本文用乙腈代替乙酸乙酯做提取液，并添加無水碳酸鈉后，成功解決了乳化，且方法操作簡單、提取效果好、前處理時間短、結果穩定性好。

關鍵詞：牛奶；甲砜霉素；高效液相色譜

甲砜霉素（Thiamphenicol，分子式為C12H15Cl2NO5S）屬于氯霉素類的抗生素，可用于敏感菌如流感嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌屬等所致的呼吸道、尿路、腸道等感染。其抗菌作用、抗菌機理及抗菌活性與氯霉素基本相似[ 1，2 ]。作為氯霉素的替代藥物在畜牧業養殖業中得到廣泛使用。甲砜霉素具有血液毒性，癥狀多為腹瀉、惡心、厭食和多發性神經炎等[ 3 ]。對造血功能的毒性較大，早期可發生血清鐵增加，白細胞、血紅蛋白及網織細胞減少，由于甲砜霉素可抑制線粒體蛋清質合成，且甲砜霉素治療后可見到與劑量相關的可逆性骨髓抑制現象。甲砜霉素可抑制紅細胞、白細胞和血小板的生成，同時有較大的免疫抑制作用，約比氯霉素強6倍。本研究針對該標準前處理方法進行優化，就標準方法與優化方法的操作、添加回收率、精密度、穩定性進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：“貴陽市三聯乳業有限公司”生產的純牛奶，-18℃保存；

甲砜霉素對照品（純度99.7%，中國獸藥監察所，批號K0241009）；

甲醇、乙腈為色譜純；

正己烷、乙酸乙酯、無水碳酸鈉為分析純；

固相萃取小柱（SPE）（C18小柱，200mg，3mL，美國Agilent）；

固相萃取小柱（SPE）（C18小柱，500mg，6mL，美國Agilent）；

高效液相色譜儀（Waters 2695型，配紫外檢測器，美國Waters公司）；

電子天平（XS105型，德國梅特勒公司）；

渦旋儀（MS2型，德國IKA公司）；

旋轉蒸發儀（LABOROTA4000型，德國Heidolph公司）；

振蕩器（GFL-3005型，德國GLF公司）；

氮吹儀（DB-3D，TECHNE公司）。

1.2 甲砜霉素標準液的配制

精密稱取甲砜霉素標準品約50.1mg（含甲砜霉素約50mg）置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度、搖勻，即成1mg/mL的的甲砜霉素標準儲備液。

精密量取甲砜霉素儲備液各1mL置于100mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻，即成10μg/mL的甲砜霉素工作液。

1.3 色譜條件

色譜柱（C18，250mm×4.6mm，5μm，美國Thermo）；流動相為乙腈-水（20∶80）；柱溫為40℃；流速為1.0mL/min；檢測波長為225nm；進樣量為20μL。在此色譜條件下對照品溶液色譜圖見圖1。

1.4 標準曲線與線性范圍的確定

精密量取10μg/mL甲砜霉素工作液用流動相梯度稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL甲砜霉素、氟苯尼考混標上機液，注入自動進樣瓶中，分別進HPLC測定，結果以峰面積（A）對藥物濃度（c）作直線回歸，甲砜霉素在0.1～2.0μg/mL范圍內，線性良好相關系數大于0.9999，標準曲線見圖2。

1.5 陽性添加樣的測定及結果

向牛奶中添加20μg/kg、40μg/kg、100μg/kg三種濃度的甲砜霉素，每種濃度作9份，分三個工作日，每個工作日取三種濃度的樣品各三份按所擬定的檢測方法處理后測定。同時做個空白樣品。

方法精密度的測定。相對標準偏差的計算公式為：相對標準偏差RSD=（標準偏差SD÷平均值）×100%。批內相對標準偏差是同一次測定的精密度，批內相對標準偏差也可視為日內精密度；批間相對標準偏差是不同批次測定的精密度。

2 前處理方法研究

2.1 方法一（《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素殘留量的測定 高效液相色譜法》）

稱取牛奶5.0±0.05g牛奶于50mL聚丙烯離心管中，加入20mL乙酸乙酯，振蕩10min。以4000r/min離心5min，取上清液置于雞心瓶中；殘渣加入乙酸乙酯20mL，重復提取1次，合并2次提取液，于45℃旋轉減壓蒸發至近干；加入5mL水于雞心瓶中，超聲5min使其溶解，轉至50mL離心管中。再加入5mL水于雞心瓶中重復溶解后轉至同一離心管中，加20mL正已烷，振蕩5min，4000r/min，室溫離心2min，取下層清液備用。C18柱依次用乙腈5mL和水5mL活化。取將備用液過柱，控制流速1min/mL，擠干，用5mL乙腈洗脫。收集洗脫液，于45℃用氮氣吹干，用流動相1.0mL溶解殘余物，濾膜過濾，供HPLC測定[ 7 ]。陽性添加樣的測定及結果見表1。100μg/kg濃度的添加樣色譜圖見圖3。

該方法為我國2014年公布實施的食品安全國家標準《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素殘留量的測定 高效液相色譜法》中的前處理方法。該方法中，由于乙酸乙酯與牛奶不互溶，在萃取過程中，會出現不同程度上乳化層，對檢測結果造成影響。

2.2 方法二

稱取牛奶5.0±0.05g牛奶于50mL聚丙烯離心管中，加入5g無水碳酸鈉，再加入5mL乙腈，再渦旋提取2min，以4000r/min離心5min，吸取上清液置于雞心瓶中（此時，乳脂會分離成液態油狀，與乙腈分層）；再加入5mL乙腈重復提取1次，合并2次提取液于同一雞心瓶中，45℃旋轉減壓蒸發至近干；加入5mL水，渦旋5min使充分溶解，轉移至10mL離心管中；再加入5mL水重復溶解1次，合并溶解液于離心管中，備用。C18柱（500mg/6mL）先后次用乙腈5mL和水5mL活化。取將備用液過柱，控制流速1min/mL，擠干，用5mL乙腈洗脫。收集洗脫液，于45℃用氮氣吹干，用流動相1.0mL溶解殘余物，濾膜過濾，供HPLC測定。陽性添加樣的測定及結果見表2。100μg/kg三種濃度的添加樣色譜圖見圖4。

該方法將提取液乙酸乙酯換為能與牛奶互溶，且極性更大的乙腈，解決了提取時乳化現象。提取時，但因乙腈沸點高于乙酸乙酯，且牛奶中的水與乙腈互溶后，濃縮耗時長，所以將提取液改為5mL，并在加入提取液前，先向樣品中加入無水碳酸鈉，去除牛奶中的水分。

3 討論與小結

1）方法一中由于乙酸乙酯與牛奶不互溶，在液液萃取時，如果振速過小，藥物提取不徹底；振搖過大，又會出現不同程度上乳化層，高速離心后乳化層仍不能分層。該方法提取過程操作復雜難度大，實驗室的溫度、振蕩強度的不同，都會對乳化程度造成影響。

方法二用乙腈取代乙酸乙酯，很好的解決了提取時的乳化現象后，只需高速渦旋2min，無需再振蕩，縮短了提取時間。方法還加入了無水碳酸鈉去除牛奶中的水，提取離心后，會出現液液分層，上層為提取液乙腈，下層為乳脂脫水后形成的油脂，取上層提取液旋蒸濃縮至近干，加水溶解即可，無需再用正己烷去脂。方法二在操作難度、提取效果、前處理時間上更優于方法一。

2）從表1、表2可看出方法一甲砜霉素在牛奶中20ng/kg、40ng/kg、100ng/kg三個濃度添加回收率在57.40%～83.00%間；而方法二三個濃度添加回收率在76.15%～95.13%間。可見方法二添加回收率優于方法一。

3）方法一甲砜霉素在牛奶中20ng/kg、40ng/kg、100ng/kg三個濃度添加，批內和批間的標準偏差分別在2.13～7.64%和6.72～12.44%間；而方法二三個濃度添加批內和批間的變異系數分別低于1.59～5.12%和1.01～2.46%。可見方法二的穩定性及精密度優于方法一。

4）本研究在前處理過程中，用乙腈取代乙酸乙酯做提取液，并在提取前加入無水碳酸鈉，獲得了較好的效果。方法簡便、快速、穩定、準確可行。

參考文獻：

[1] 林慶華.抗生索在獸醫臨床應用上的進展.福建畜牧獸醫，2000，22（3）39-44

[2] 徐仲鈞等.甲砜霉素散對雞巴氏桿菌病治療及毒性試驗.中國獸藥雜志，1996，30（2）34-35.