小鼠隱睪模型中睪丸質量和組織病理學變化及臨床意義*

高 攀　張賢生高晶晶 黃遠遠 梁朝朝

安徽醫科大學第一附屬醫院（合肥 230022）

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·論著·

小鼠隱睪模型中睪丸質量和組織病理學變化及臨床意義*

高 攀張賢生**高晶晶 黃遠遠 梁朝朝

安徽醫科大學第一附屬醫院（合肥 230022）

摘要目的 研究小鼠隱睪模型中睪丸的質量及組織病理學變化，并探討其臨床意義。方法 取50只6周齡ICR雄性健康小鼠，隨機選取25只，造左側隱睪模型，視為隱睪組；另外25只小鼠，左側睪丸適度牽拉仍保持原位置不動，視為假手術組。再隨機分成5組，每組包含5只隱睪小鼠，5只假手術小鼠。術后3d、7d、14d、21d和28d分別頸椎離斷處死各組小鼠，記錄每只小鼠的體質量和兩只睪丸的質量，觀察睪丸的組織病理學變化并依據Johnsen評分標準進行評分。結果 （1）各個時間段隱睪組小鼠與假手術組體質量的比較無統計學意義（P＞0.05）；（2）隱睪組小鼠兩側睪丸臟體比（臟器質量/體質量×1 000）的比較均有統計學意義，假手術組兩側睪丸臟體比的比較無統計學意義（P＞0.05）；（3）隱睪的質量從第7天開始減少并以一種時間依賴方式遞減，差異有統計學意義（P＜0.05）。與此同時，假手術組兩側睪丸質量改變不具有統計學意義（P＞0.05）；（4）Johnsen評分從術后第3天開始，隱睪側睪丸的評分均低于其對側睪丸且呈遞減趨勢；（5）睪丸的組織病理學變化與睪丸的質量變化一致，第7天生精細胞開始凋亡并以一種時間依賴的方式凋亡。結論 實驗性隱睪小鼠模型表明隱睪在腹腔中以一種時間依賴方式在改變，存在一個時間段，可能是實施干預治療最恰當的時機，有望更好的恢復睪丸的生精功能。

關鍵詞隱睪； 睪丸質量；細胞凋亡

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.001

隱睪癥是指睪丸未能按正常發育過程通過腹股溝管沿著腹膜鞘突下降至陰囊底部，而是停留在下降途中的任何部位，也稱睪丸下降不全，是小兒最常見的男性生殖系統先天性疾病之一。隱睪癥在足月新生兒中的發病率約為2%～4%［1］，是導致男性不育的重要因素之一［2］。目前對于隱睪癥的治療并不十分成熟，新生兒隱睪往往選擇激素治療，而對于大多數隱睪手術治療往往是最佳選擇。目前超過60%的隱睪手術實施在年齡大于2歲的患兒［3， 4］。研究表明睪丸在腹腔中的時間越長，腹腔的熱環境對于睪丸發育的負面影響越大，主要表現為睪丸不斷的萎縮和生精功能受損，以至于發展成為少弱精子癥甚至是無精子癥［5］。本實驗通過建立小鼠隱睪模型，觀察睪丸質量以及睪丸的組織病理學變化并依據Johnsen評分標準進行評分，探索兩者變化之間的相關性，為探究隱睪手術最佳時機的選擇提供理論依據。

材料與方法

一、實驗動物

正常生長的50只健康ICR雄性小鼠（6周齡），均由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

二、主要儀器與試劑

0.3%戊巴比妥鈉、整套手術器械、BS-1105型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司）、蘇木精、尹紅、光學顯微鏡、甲醛、生理鹽水、二甲苯、不同梯度濃度的乙醇（100%、95%、75%）。

三、實驗方法

（一）實驗動物準備

50只雄性ICR小鼠，實驗前適應性飼養一周，小鼠自由飲食飲水，12/12h晝夜交替飼養，飼養環境溫度（22±2）℃、濕度為（50±5）%，1周后造模。所有實驗均遵循安徽醫科大學動物實驗中心制定的實驗動物守則。

（二）小鼠隱睪模型的建立

隨機選取25只小鼠，每只小鼠用0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg腹腔內注射）麻醉，腹部備皮消毒后左下腹做一2cm小切口，打開腹腔，輕輕上托左側睪丸，牽拉其至腹腔，剪斷引帶，脂肪墊縫合在腹壁上，右側睪丸仍保持原位置不動，不做任何處理，此25只老鼠作為隱睪組，右側睪丸作為自身對照。其余25只小鼠，做相同腹部切口，打開腹腔后輕輕牽拉左側睪丸，仍然保持睪丸位于陰囊內，右側睪丸同樣保持原位置不動，不做任何處理，此25只小鼠作為假手術組。再隨機分成5組，每組包含5只隱睪小鼠，5只假手術小鼠。術后所有小鼠均飼養在相同的環境下：12/12h晝夜交替飼養，飼養環境溫度（22±2）℃、濕度為（50±5）%，小鼠自由飲食飲水。

（三）稱量和取材

手術后按實驗設計的時間：術后第3天、7天、14天、21天、28天分別頸椎離斷處死5只隱睪組和5只對照組小鼠，天平稱量每只小鼠的體質量并記錄，取出左、右側睪丸，稱量并記錄。睪丸取出后，生理鹽水清洗，以濾紙包裹后于10%甲醛溶液中固定。

（四）睪丸組織病理學檢查

獲取睪丸組織后，常規石蠟包埋、切片及HE染色。光學顯微鏡下觀察至少25個生精小管斷面，并依據睪丸組織病理學特點及Johnsen評分標準［6］進行分析歸納和評分（見表1）。

表1　Johnsen 評分標準

（五）統計學分析

使用SPSS 17.0統計分析軟件進行數據分析，相關數據以均值±標準差的方式表示，組間數據的比較主要采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

結　 果

一、睪丸質量

各個時間段（術后3d、7d、14d、21d、28d）小鼠體質量的變化沒有統計學意義，表明手術對小鼠的正常生長無明顯影響（見表2）。隱睪組小鼠兩側睪丸臟體比（臟器質量/體質量×1 000）的比較均有統計學意義，假手術組兩側睪丸臟體比的比較無統計學意義（P＞0.05），表明手術本身對隱睪睪丸的變化無明顯影響（見表3）。隱睪睪丸的質量以一種時間依賴方式遞減，其對側睪丸質量反而有所多增加，有統計學意義（P＜0.05）；假手術組兩側睪丸質量的變化無規律性，變化不具有統計學意義（P＞0.05（見表4、圖1）。

表2　各個時間段隱睪組小鼠與假手術組小鼠體質量變化比較（±s，g）

表2　各個時間段隱睪組小鼠與假手術組小鼠體質量變化比較（±s，g）

注：UC = 隱睪組，SO =假手術組

UC　SO　95% CI 　t　P 3d 　27.22±2.73　27.71±1.79　　（-4.15，3.15 ）　-0.38　0.73 7d　30.54±2.22　30.67±1.78　　（-3.09，2.83 ）　-0.12　0.91 14d　35.00±0.94　33.57±1.48　　（-4.57，7.44）　1.03　0.41 21d 　37.40±3.40　33.11±4.31　　（-9.64，18.24）　1.33　0.32 28d　34.47±7.63　40.91±3.67　　（-21.27，8.40）　-1.87　0.20

表3　隱睪組小鼠和假手術組小鼠的兩側睪丸臟體比的比較（±s）

表3　隱睪組小鼠和假手術組小鼠的兩側睪丸臟體比的比較（±s）

注：Cry=隱睪組隱睪側睪丸；SC=隱睪組隱睪側睪丸自身對照；T1=假手術組右側睪丸；T2=假手術組左側睪丸；器官的臟體比=器官的重量/體重×1 000

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表4　隱睪組小鼠和假手術組小鼠的兩側睪丸自身質量的比較（±s，g）

表4　隱睪組小鼠和假手術組小鼠的兩側睪丸自身質量的比較（±s，g）

注：Cry=隱睪組隱睪側睪丸；SC=隱睪組隱睪側睪丸自身對照；T1=假手術組右側睪丸；T2=假手術組左側睪丸

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圖1　術后不同時間段隱睪組隱睪側睪丸和其自身對照組睪丸質量的變化Cry=隱睪組隱睪側睪丸， SC=隱睪組隱睪側睪丸自身對照

二、小鼠睪丸組織HEHE染色結果及Johnsenhnsen評分結果

HE染色發現睪丸的組織病理學變化與睪丸的質量變化一致，且從第7天生精細胞開始凋亡并以一種時間依賴方式凋亡（見圖2）。在術后第3天，隱睪組小鼠的隱睪睪丸和自身對照側睪丸生精周期清晰可見并可見大量精子（見圖2A2A、圖2B2B）。而第7天隱睪側的睪丸中精子數量與自身對照側睪丸相比大幅度減少（見圖2C2C、圖2D2D），但生精細胞仍然可見（見圖2C2C）。隨著術后時間的延長，隱睪對側睪丸的功能開始受影響。術后第14天，隱睪側睪丸的生精小管大多只有少數精母細胞存在，其自身對照側睪丸精子數量也減少。到術后第21天，不僅隱睪側睪丸其自身對照側睪丸生精小管也變空。但是，第28天，自身對照側睪丸中可見大量生精細胞，隱睪側只見少量初級精母細胞，無精子。同樣，Johnsen評分發現，在各個時間段（術后3、7、14、21、28d）隱睪的評分明顯低于其自身對照組，且隱睪側睪丸的評分呈遞減趨勢（見表5）。

表5　各個時間段隱睪組隱睪側睪丸與其自身對照Johnsen評分的比較（±s，分）

表5　各個時間段隱睪組隱睪側睪丸與其自身對照Johnsen評分的比較（±s，分）

注：Cry=隱睪組隱睪側睪丸；SC=隱睪組隱睪側睪丸自身對照

Cry　SC　95% CI　t　P 3d　9.00±0.65　10.00±0.00　　（0.73，1.27 ）　7.75　0.00 7d　7.40±0.50　9.40±0.50　　（1.62，2.38 ）　10.95　0.00 14d　5.00±0.65　8.60±0.82　　（3.22，3.98）　19.72　0.00 21d　5.40±0.50　7.00±0.65　　（1.26，1.94）　9.80　0.00 28d　3.60±0.82　8.80±0.41　　（4.84，5.56）　30.02　0.00

圖2　術后不同時間段睪丸組織HE染色（×100）

討　 論

隱睪是小兒最常見的男性生殖系統先天性疾病之一，是男性不育和睪丸腫瘤的重要危險因素［1］。1949年Harrison等的研究表明腹腔中的溫度比陰囊高4～5℃［7］，此后Chandra等的研究也表明這個溫度差正是隱睪導致精子發生障礙的重要原因［8］。Goel等研究亦表明睪丸處在腹腔中溫度相對較高的環境下，缺乏精子發生的正常微環境，不能生成成熟精子，導致生育能力的喪失或低下［9］。

在前人研究的基礎上我們知道隱睪中睪丸的損傷是繼發于睪丸的位置異常，這種損傷的表現就是睪丸生精細胞的凋亡，而在睪丸形態學上的表現就是睪丸的萎縮。所以睪丸的萎縮從另一個角度反映了生精細胞的凋亡和不育的發生［10］，換句話說，睪丸體積的大小與今后的生育能力呈正相關。與睪丸的體積相同，在我們的研究中發現隱睪睪丸的質量是以一種時間依賴的方式在改變。Nishimune等的研究發現實驗性小鼠隱睪在術后第5周其質量明顯低于對照組［11］。同樣，Wang等也做了一項關于小鼠隱睪睪丸質量變化的實驗，在他們的研究中發現隱睪睪丸的質量在腹腔中是以一種時間依賴的方式改變，且在術后第10天的改變有意義，而在術后第7天隱睪中生殖細胞凋亡率就明顯高于對側陰囊中的睪丸（81.87% vs 52.37%）［12］。因此，我們推測睪丸在腹腔中有一個確切的時間段其功能開始受影響，手術松懈固定在這個時間之前，能最大程度的挽救睪丸的功能，也能最大程度的減少不育的發生。

鑒于隱睪帶來的不良后果：不育和睪丸腫瘤的發生，目前治療隱睪的方法有觀察等待、激素治療、手術治療等。但對于何時采用何種方法治療仍存在很多爭議，近乎70%的隱睪在出生后3～6個月會自發下降到陰囊，6個月之后很少有自發下降的，此時往往選擇激素治療，而激素治療的成功率只有15%～20%［13］。之后人們才會考慮手術，手術往往是最直接也是效果最確切的治療方式，手術實施的越早越能降低不育的發生，越能阻止睪丸的惡性轉變［14， 15］。由于大多數隱睪患兒就診比較晚，且大多數中國父母對患兒年齡太小實施手術有所顧慮，目前對于隱睪手術的實施尚未形成統一的認識，也缺乏理論依據。爭議最大的還是手術治療時機的選擇，最理想的手術時機目前還不清楚，既往文獻報道睪丸固定術的最佳年齡為1～2歲，這樣能阻止睪丸生精細胞的凋亡和睪丸退行性病變［16，17］。2009年德國的官方指南推薦手術年齡為1歲［18］，甚至有人認為越小實施手術越有利，建議在出生后3～9個月內進行手術，以逆轉隱睪所帶來的不良后果［19］。目前，在臨床上隱睪患兒實施手術的年齡推薦為1～2歲，但此手術年齡的選擇在病理學改變上和手術后睪丸功能的恢復情況不完全相符，也沒有直接的證據表明早期手術利于睪丸功能的恢復。到目前為止只有Feyles等提出有力的證據表明早期手術優于晚期手術。在他們的研究中，隨訪了27例在1歲之前行睪丸松懈固定術的患者，26例患者精液分析精子質量正常；24例在1～2歲行睪丸松懈固定術的患者，只有18例患者精液分析精子質量正常；兩組精子活力的比較：96.3% vs 66.7%［16］。在我們的研究中，隨著術后時間的延長，隱睪對側睪丸的功能也受到一定程度的影響，但是由于對側睪丸所處的微環境有利于睪丸的發育，因此對側睪丸在受損后會有一定程度的自我修復。也就是說，早期的睪丸松懈固定術使睪丸降至利于其發育的微環境，對于睪丸功能的恢復是有利的。

隱睪會使睪丸生精細胞凋亡增加 ，隱睪下降固定能通過減少生精細胞凋亡而改善生精功能 ，部分隱睪固定術后仍不能完全恢復生育能力，可能與生精細胞凋亡仍較正常睪丸高有關，這可能與手術時間的選擇有關。本實驗通過建立小鼠隱睪模型，觀察睪丸質量以及睪丸的組織病理學變化，并依據Johnsen評分標準進行評分，發現存在一個時間段睪丸的生精功能開始受影響，這也許可以作為制定隱睪最佳手術時機的理論依據。為進一步明確手術時間與小鼠生育力的相關性，指導手術時機的選擇，為臨床隱睪患者術后生育力的研究提供了新的實驗依據。

參 考 文 獻

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12Wang ZQ， Watanabe Y， Toki A， et al. Altered distribution of Sertoli cell vimentin and increased apoptosis in cryptorchid rats. J Pediatr Surg 2002； 37（4）∶ 648-652

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（2015-11-08收稿）

中圖分類號R 697.22

*基金資助項目：國家自然科學基金（81370749）

The changes of the testicular weight and histology in cryptorchidism mouse model and its clinical signifi cance*

Gao Pan， Zhang Xiansheng**， Gao Jingjing， Huang Yuanyuan， Liang Chaozhao
The First Affi liated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022， China Corresponding author∶ Zhang Xiansheng， E-mail∶ xiansheng-zhang@163.com

AbstractObjectiveTo investigate the changes of the testicular weight and histologic in cryptorchidism mouse model and explore its clinical signifi cance. MetthhooddssTwenty-fi ve mice which were random selected from the Fifty sixweek-old ICR male mice were induced to be unilateral cryptorchidism， defi ned as the cryptorchidism mouse model group，and the other twenty-fi ve mice defi ned as the sham operation group. Then， the total fi fty mice were random divided into fi ve groups， each group included fi ve cryptorchidism mouse and fi ve sham operation mouse. After the operation， the mice were sacrifi ced at 3， 7， 14， 21 and 28 days， respectively. The body weight and testes weight were measured individually at the end of the experimental period. All the tissues were stained with hematoxylin and eosin， and observed under a light microscope. Sperm formation disorder was evaluated in each time point using the Johnsen score （JS）. Ressuullttss （1）No significant change in body weight was found between cryptorchidism mouse model group and the sham operation group（P＞0.05）； （2） There was a statistics signifi cance in the organ coeffi cients （organ weight/bodyweight×1 000） of the two testes in the cryptorchidism mouse model group， but no statistics signifi cance in the sham operation group ； （3）In the unilateral cryptorchidism mice， the testicular weight of cryptorchid were signifi cantly decreased from the 7 day after surgery to the end of the experiment versus itself （P＜0.05）， and decrease in the weight of cryptorchid testes was a time-dependent.（4）From the postoperative 3 day， a time-dependent decrease in sperm number was observed in the cryptorchid testes. （5） The pathological changes of testis tissue was congruence with the changes of the testicular weight . From the postoperative 7 day，the apoptosis of spermatogenic cell were started and the change mode was a time-dependent. ConcluussiioonnThere was a timedependent change of the cryptorchidism in the cryptorchidism mouse model， and maybe there is a period of time point which is the exact time to perform intervention and treatment for better recovery of spermatogenic function in testes.

Key wordscryptorchidism； testicular weight； apoptosis

**通訊作者，E-mail∶ xiansheng-zhang@163.com