基于AFLP標記的苦蕎種質資源遺傳多樣性研究

高帆++宋餠

摘要：用AFLP分子標記手段對我國苦蕎種質資源遺傳多樣性進行研究，為綜合評價我國苦蕎種質資源提供依據。以50份苦蕎核心種質為試驗材料，優化篩選出19對AFLP標記分析引物，經AFLP-PCR擴增、PAGE檢測，統計分析AFLP圖譜，運行Popgene Ver.1.31和NTSYSpc Ver.2.2軟件對苦蕎種質資源遺傳多樣性和遺傳關系進行分析，共檢測到211個AFLP特異性標記，平均每對引物組合產生11.11個多態性位點（PIC），遺傳相似系數（GS）分布區間均較大，變幅為0.515～0.954，辛普森指數和香農指數計算結果表明來自四川的苦蕎種質資源多樣性最為豐富；Popgene Ver.1.31運行結果表明，當GS為0.790時，50份苦蕎材料被分為5個組群，聚類結果與苦蕎種質的地理分布有一定的相關性。說明AFLP是一種有效的分子標記方式，適合于苦蕎種質遺傳多樣性分析；我國苦蕎種質資源多樣性豐富，須要在保護、利用現有種質資源的基礎上繼續加強區域間引種、育種，為我國蕎麥產業的發展提供幫助。

關鍵詞：苦蕎；AFLP；遺傳多樣性

中圖分類號： S517.024文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0122-05

苦蕎（Fagopyrum tataricum）屬廖科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill），尼泊爾、我國西藏東部和云南西北部是苦蕎的分布中心和起源地[1]。我國是苦蕎的主產區，栽培面積超過30萬hm2，產量水平達900 kg/hm2，總產量達3億kg[2]。苦蕎糧藥兼用，不僅營養價值高，而且具有降糖脂、降膽固醇、抗氧化和消炎等功效，被譽為21世紀重要的綠色食品資源[3]。我國苦蕎種質資源豐富，利用AFLP分子標記對我國苦蕎種質資源遺傳多樣性進行分析對我國苦蕎種質資源的保護、品種的改良、分子育種及優良基因的挖掘具有重要的意義。盡管國內外學者已采用形態學標記[4]、細胞學標記[5]、種子蛋白標記[6]和同功酶標記[7]等手段對蕎麥的遺傳多樣性進行分析，但分子標記技術仍然是目前最主要的遺傳多樣性分析手段，國內外已采用RAPD[8]、SSR[9]、ISSR[10]和SRAP[11]等分子標記方式對苦蕎遺傳多樣性進行了研究。AFLP是一種可靠性高、適用性強、多態性水平高的分子標記方式，非常適合于對研究背景模糊、材料來源廣泛的作物進行標記分析。Tsuji等利用AFLP標記技術對野生苦蕎和栽培苦蕎進行了系統研究[12]；Yasui等利用AFLP標記，構建了野生蕎（F. homotropicum）和甜蕎的8個連鎖群的遺傳圖譜[13]；Konishi等利用AFLP標記揭示了野生甜蕎和栽培甜蕎間的起源關系[14]；侯雅君等對百余份苦蕎材料進行了遺傳多樣性分析[15]。以上研究雖利用不同的標記方式對苦蕎進行了遺傳多樣性分析，但利用AFLP標記分析我國極具代表性的苦蕎核心種質（精準鑒定品種）的研究幾乎沒有。盡管到目前為止國內外已有一些關于苦蕎AFLP標記方面的報道，但大多數分析范圍或是過于狹窄或是過于寬泛，分析材料多數不具有典型的地域代表性。本研究在前人研究的基礎上，從國家種質庫中精心挑選出50份極具代表性的苦蕎精準鑒定材料為研究對象，從40對引物組合中篩選出19對信息量豐富、多態性好的AFLP引物，對我國苦蕎種質資源進行遺傳多樣性分析，旨在揭示我國苦蕎種質資源間的遺傳關系，為苦蕎種質資源的收集、保護、利用提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

我國苦蕎精準鑒定材料50份，分別來自12個省（區），具體情況見表1，供試材料由中國農業科學院農作物種質保存中心提供。

1.2DNA提取與酶切

取0.5 g嫩葉，用CTAB法[16]提取總DNA，稀釋100倍后表1苦蕎品種名稱及來源

編號品種名稱來源編號品種名稱來源1黑豐1號山西26苦蕎陜西2六蕎2號貴州27苦蕎陜西3苦蕎陜西28刺蕎四川4苦蕎麥安徽29苦蕎貴州5苦蕎陜西30苦蕎寧夏6苦蕎陜西31蕎麥山西782-8-1安徽32蕎麥甘肅8苦蕎陜西33遼蕎75（苦）遼寧9苦蕎四川34黑苦蕎青海10苦蕎陜西35湖南2-2湖南11苦蕎山西36塘彎苦蕎湖南12威寧3號貴州37六蕎1號貴州13苦蕎湖北38湖南1-2湖南14額洛木爾惹四川39苦蕎青海15湖南3-1湖南40湖南6-2湖南16海源苦蕎寧夏41晉蕎麥2號山西17鳳凰苦蕎湖南42苦蕎青海18湖南5-2湖南43苦蕎麥安徽19苦蕎陜西44苦蕎麥甘肅20苦蕎湖北45苦蕎湖北21西農9909陜西46鎮巴苦蕎Ⅱ陜西22彭澤苦蕎江西47老鴉苦蕎四川23洗馬苦蕎湖南48麻苦蕎甘肅24苦蕎湖北49新邵苦蕎湖南25麻苦蕎甘肅50湖南3-2湖南

參考閆龍等的試驗方法[17]，37 ℃條件下用MseⅠ和EcoRⅠ對總DNA酶切8h，檢測酶切效果。

1.3加接頭與預擴增

將酶切產物分別加上EcoRⅠ和MseⅠ接頭。在T4連接酶的作用下，16 ℃過夜連接后獲得連接產物，稀釋5倍后用預擴增引物M（5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′）和E（5′-GACTGCGTACCAATTC-3′）進行預擴增反應。預擴增反應體系為：連接產物4.0 μL，M引物1.0 μL，E引物1.0 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP 0.4 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O補齊至20μL。預擴增反應程序為：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 7 min。檢測預擴增效果后，稀釋20倍備用。

1.4引物篩選與選擇性擴增

選用遺傳差異較大的7份苦蕎材料對40對AFLP引物組合進行篩選，篩選出擴增條帶數量多、多態性好、清晰度高、分布均勻的19對引物組合：E-AA/M-CAG、E-AA/M-CTG、E-AC/M-CCC、E-AG/M-GCA、E-GA/M-CGT、E-GC/M-ACG、E-GC/M-CCT、E-GG/M-GAT、E-GG/M-GCA、E-TG/M-ACG、E-CTG/M-AC、E-CTG/M-CG、E-CTG/M-TT、E-GCT/M-CG、E-GCT/M-CT、E-GTC/M-CC、E-ACA/M-GT、E-ACT/M-CAG、E-ACT/M-CTG。獲取有效的AFLP引物組合后，進行選擇性擴增反應。選擇性擴增反應體系為：預擴增產物2.5 μL，AFLP引物組各0.8 μL，10×PCR buffer 1.5 μL，dNTP 0.3 μL，Taq酶 0.15 μL，ddH2O補齊至15 μL。選擇性擴增反應程序為：94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 35 s（每個循環降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，12個循環；94 ℃ 30 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，25個循環；72 ℃ 7 min。反應結束后加入5 μL Loading buffer，94 ℃ 變性3 min后立即置于冰上冷卻備用。

1.5PAGE檢測與數據統計分析

參考趙麗娟的方法[18]進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測，固定、銀染、顯影后用拍照計數。在電泳圖譜上，清晰條帶記為“1”， 同一位置上無條帶記為“0”。用Popgene Ver.1.31 軟件[19]計算多態性信息指數（PIC）、多態性性息位點百分數（PPB）、辛普森指數（Simpson index）、香農指數（Shannon-Weaver index）、遺傳相似系數（GS）。根據GS， 采用UPGMA法，利用NTSYSpc Ver.2.2軟件[20]進行苦蕎品種聚類分析。

2結果與分析

2.1酶切與預擴增檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測苦蕎基因組DNA酶切和預擴增結果見圖1。由圖1-A和圖1-B結果可知，DNA酶切片段均勻，預擴增片段豐富，基本位于100～750 bp之間，適宜進行選擇性擴增[21]。

2.2選擇性擴增檢測

本研究從40對AFLP引物組合中篩選出適宜的選擇性擴增引物19對，篩選率為47.5%。19對引物在50份苦蕎材料上共擴增出清晰條帶890條（圖2），平均每對引物可擴增出條帶46.84條，長度分布在45～570 bp之間。如表2所示，共擴增出多態性條帶211條，平均每對引物的多態性條帶有11.11條，平均多態性位點百分率（PPB）為24.05%，PIC最大值為0.1918（引物組合為E-CTG/M-CG），最小值為 0.024 1（引物組合為E-AA/M-CAG），PIC平均值為 0.123 2。

2.3苦蕎種質遺傳多樣性分析

鑒于有些地區有代表性的苦蕎核心種質材料太少，將少于4份材料的省份劃分至與其毗鄰或種植環境相似的省份，計算各組群苦蕎種質資源的遺傳多樣性參數。由表3可知，AFLP標記的苦蕎品種，辛普森指數為0.892～0.989，平均 0.940；香農指數為0.095～0.194，平均0.153。四川是我國苦蕎遺傳多樣性最為豐富的地區，無論辛普森指數（0.989），還是香農指數（0.194）均為最大。雖然湖南和陜西的供試材料最多（均為10份），但遺傳多樣性并不豐富，這從分子水平上證明資源量與遺傳多樣性并非正相關的觀點。安徽/江西、寧夏/青海2個組群的辛普森指數和香農指數均較低，說明該地區的苦蕎種質資源多樣性不夠豐富，需要在保護其遺傳穩定性的基礎上，加強區域間引種。部分省份的核心種質抽樣材料太少（如江西和遼寧各僅有1份），這也可能對遺傳多樣性參數值的計算造成一定的誤差[22]，不能完全反映該區域內的種質資源多樣性情況。

2.4苦蕎種質遺傳關系分析

用NTSYSpc Ver.2.2軟件計算50份苦蕎種質的遺傳相似系數（GS）。AFLP標記結果（表4）表明，50份苦蕎種質的GS值在0.515～0.954之間，分布區間較大，說明苦蕎種質多態性較為豐富，同時也表明AFLP標記適宜于我國苦蕎種質遺傳多樣性分析。

采用UPGMA法進行聚類，當GS為0.790時，大部分苦蕎材料可被分成五大組群。第Ⅰ組群可分為2個小組，第1小組包括來自山西（1）、陜西（5、6）、湖南（17、18、40）、甘肅（32）和青海（39）的8份材料，其中山西和陜西的材料聚為一類，湖南、青海和甘肅的材料聚為一類；第2小組包括來自安徽（7）、陜西（21、10、19）和湖北（13、20、24）的7份材料，其中安徽（7）、陜西（21、10、19）和湖北（13）的材料聚為一類，而另2份湖北材料（20、24）聚為另一類。第Ⅱ組群可分為2個小組，第1小組又可分為2個亞組，第1亞組包括來自陜西（3、27、26）、安徽（4）、甘肅（25）、湖南（35、36、38）和山西（41）的9份材料，第2亞組包括來自安徽（43）、甘肅（44）、湖北（45）、陜西（46）和湖南（49，50）共6份材料；第2小組包括山西（11）和遼寧（33）的2份材料。第Ⅲ組群包括來自山西（31）、青海（42）、四川（47）和湖南（23）的4份材料。第Ⅳ組群包括來自貴州（2、12、29、37）、四川（9、28）和寧夏（16）的7份材料，其中來自貴州（29）和四川（28）的2份材料遺傳相似度最近， 為0.954。第Ⅴ組群包括來自江西（22）、寧夏（30）和湖南（15）的3份材料。剩余的來自四川（14）、青海（34）、陜西（8）和甘肅（48）的4份材料與以上5個組群的遺傳距離較遠，單獨聚為一類特殊的類型（圖3）。

由聚類圖（圖3）可知，來自四川和貴州的刺蕎和苦蕎GS值最高（0.954），原因可能是四川的刺蕎屬于當地地方品種有翅苦蕎的一類，而來自貴州的苦蕎也是當地的一個地方品種，兩者同屬于苦蕎的栽培品種，兩地也同屬我國栽培蕎麥的主產區—西南地區，地理位置接近及品種交流頻繁等因素導致兩者遺傳相似性較高。來自四川的額洛木爾惹和來自甘肅的麻苦蕎GS值最低（0.515），原因可能是甘肅的麻苦蕎為當地的一個栽培品種，四川的額洛木爾惹來自于川西南部的涼山彝族自治州，該地區地貌復雜，具有獨特的生態氣候，是我國苦蕎麥主要的生產和次生起源地之一，蕎麥種質資源豐富[23]，而該品種也很可能是當地野生蕎麥的一個近緣種，豐富的蕎麥遺傳資源背景造成四川的額洛木爾惹與甘肅的麻苦蕎遺傳差異度較大。

3結論與討論

3.1AFLP標記技術的有效性和適用性

自AFLP標記技術被發明以來，該技術以其特殊的標記特點被廣泛應用于作物分子標記分析和遺傳多樣性研究中。國內外專家均認為，AFLP是一種有效的分子標記系統[24-25]。本研究的苦蕎種質資源AFLP標記結果表明，AFLP標記豐富度高（19對引物組擴增出890個條帶）、靈敏度強（平均每對引物擴增條帶46.84個）。AFLP標記位點多態性豐富（平均多態性比率為25.7%），有效性強（平均每對引物可擴增 11.11 個多態性條帶，高于RAPD標記苦蕎所得的6.90個多態性條帶[8]）。有效的AFLP引物組合篩選率較高（引物篩選率47.5%，高于SSR[9]和ISSR[10]的引物篩選率）。以上結果表明，AFLP是一種十分適合于苦蕎種質資源多樣性分析的標記方式。進一步擴大引物遴選范圍，篩選出更多的AFLP擴增引物，建立苦蕎AFLP引物擴增庫是下一步的工作重點。

3.2苦蕎種質資源的遺傳多樣性

從不同來源苦蕎種質的遺傳關系發現，我國苦蕎種質資源遺傳多樣性十分豐富[26]；從不同組群苦蕎品種的遺傳參數值發現，四川地區的種質資源遺傳多樣性最為豐富，是我國苦蕎種質資源的重點保護地區；從UPGMA聚類圖發現，處于相近地理范圍內的苦蕎品種可聚在一起，這體現了我國苦蕎種質資源遺傳關系的地緣性特征。因此，需要在加強區域內苦蕎種質資源保護的基礎上，不斷加強區域間的引種、育種，尤其是針對某些特殊珍貴品種（如四川的額洛木爾惹）的保護與開發，這將不斷豐富我國苦蕎種質資源的遺傳多樣性。本研究結果為我國苦蕎種質資源的保護和利用、品種的開發以及蕎麥產業的發展提供必要的參考依據。

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