阿托伐他汀對老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后細胞凋亡的影響

張云云　黃玲玲　王　濱　洪　侃　萬鶴鳴　陸守榮　丁新生

(南京醫科大學附屬無錫市人民醫院，江蘇　無錫　214000)

?

阿托伐他汀對老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后細胞凋亡的影響

張云云黃玲玲王濱洪侃萬鶴鳴陸守榮丁新生1

(南京醫科大學附屬無錫市人民醫院，江蘇無錫214000)

〔摘要〕目的探討阿托伐他汀對老齡大鼠永久局灶性胡須體覺皮層缺血后凋亡的影響及機制。方法45只老齡大鼠依隨機數字表法分為假手術組、對照組(等量生理鹽水)、阿托伐他汀處理組(20 mg/kg)。對照組及阿托伐他汀組于顯微鏡下結扎大腦中動脈數根分支構建局灶胡須體覺皮層缺血模型并于造模后0、6、24、48 h分別以生理鹽水及阿托伐他汀灌胃。造模后72 h應用蘇木精-伊紅(HE)染色檢測腦組織形態學；流式細胞儀檢測各組缺血區周圍細胞凋亡及壞死率；免疫組織化學染色檢測缺血區周圍Caspase-3 及血管內皮生長因子受體(VEGFR)-1 的表達。結果與對照組相比，阿托伐他汀對老齡大鼠72 h后有抗凋亡作用，其機制可能與減少缺血區周圍Caspase-3表達有關。該劑量阿托伐他汀對缺血后72 h的VEGFR-1表達無明顯影響。結論阿托伐他汀可能通過減少老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h的Caspase-3表達起著較好的抗凋亡作用。

〔關鍵詞〕阿托伐他??；腦缺血；凋亡

流行病學調查顯示年齡超過55歲后，腦卒中的風險每十年增加1倍，而且其神經祖細胞及非成熟神經元隨著年齡的增長逐漸增加。本研究探討阿托伐他汀對老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h凋亡及壞死影響及可能機制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器雄性SD大鼠20～22 月齡45只。阿托伐他汀輝瑞制藥公司。AnnexinV-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司。Caspase-3、血管內皮生長因子受體(VEGFR)-1抗體購自Santa-Cruz公司。免疫組化試劑盒武漢博士德生物有限公司。FACSCalibur流式細胞儀美國BD公司。Leica 彩色圖像分析系統；GS-2010 手術顯微鏡(常州三能光學設備有限公司)；10-0帶線縫合針(上海醫菱醫療器械銷售公司)，多導生理記錄儀、TSD 激光多普勒探頭、激光多普勒血流儀(Biopac公司，美國)。

1.2模型制備大鼠麻醉后固定在手術臺上，切開顳部皮膚和肌肉，用手術電鉆開6～8 mm的顱窗，刺激對側胡須，激光多普勒血流儀測定刺激前后局部腦血流，確定體覺皮層支配血管后在顯微鏡下以10-0 手術線穿過硬腦膜，結扎胡須體覺皮層周圍數根大腦中動脈的分支，激光多普勒血流儀再次測定局部腦血流，同時結扎雙側勁總動脈10 min。假手術組的大鼠麻醉后固定在手術臺上，切開顳部皮膚和肌肉，用手術電鉆開6～8 mm顱窗，不結扎大腦中動脈樹根分支〔1〕。

1.3大鼠分組45只老齡大鼠隨機分為假手術組、對照組及阿托伐他汀組，對照組及阿托伐他汀組予術后0、6、24、48 h以20 mg/kg生理鹽水及阿托伐他汀灌胃，72 h后處死各組大鼠。

1.4病理學觀察假手術組、對照組及阿托伐他汀組進行常規蘇木精-伊紅( HE) 染色,光鏡下觀察腦缺血72 h后組織形態學改變。

1.5流式細胞儀檢測缺血區凋亡各組大鼠處死于75%酒精浸泡1～3 min放置超凈工作臺，取出大腦缺血區及周圍組織并將其置于事先消毒好的200目篩網,輕輕研磨腦組織，使其變成單個細胞，待研碎后用培養液沖洗，細胞篩下容器內所盛溶液為單細胞懸液；將細胞重懸于500 μl上樣緩沖液,加入5 μlAnnexinV-FITC 和5 μl PI,混勻后室溫避光反應10 min，上機檢測。

1.6取材及切片制備72 h后各組分別取5只大鼠麻醉后打開腹腔，剪開肋骨，經左心室插管至主動脈后快速依次灌注生理鹽水及4%多聚甲醛，斷頭取腦分離前囟前后1 mm腦組織浸入4%多聚甲醛固定6 h，蒸餾水漂洗，酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋，連續切片5 張，片厚5 μm。

1.7免疫組化染色檢測缺血區周圍Caspase-3及VEGFR-1表達常規脫蠟至水，以Caspase-3、VEGFR-1抗體為一抗進行操作，方法參照試劑盒說明書。DAB 顯色，蘇木素復染，封片鏡檢。PBS 代替Caspase-3、VEGFR-1抗作陰性對照。采用Leica計算機圖像分析系統對組織切片圖像分析，以細胞呈棕色或棕褐色為標準，每張切片計算5個不重復的視野計數，取其平均值來作為Caspase-3、VEGFR-1的陽性細胞數。

1.8統計學分析用SPSS16.0軟件,行單因素方差分析，方差齊時進一步采用LSD進行兩兩比較。

2結果

2.1HE染色假手術組腦組織細胞正常，老齡大鼠腦缺血后72 h神經元及膠質細胞變性，胞核溶解，可見較多細胞碎片。阿托伐他汀組老齡大鼠缺血后72 h神經元及膠質細胞亦有水腫、變性壞死，但較模型組細胞稍完整(圖1)。

圖1　老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h病理學觀察(HE，×200)

2.2流式細胞儀檢測缺血區凋亡情況假手術組可見少量凋亡及壞死細胞，對照組及阿托伐他汀組的細胞凋亡及壞死細胞數較相應假手術組均明顯增加，與對照組缺血72 h組相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h組的凋亡及壞死細胞數明顯減少(表1)。

2.3免疫組化染色檢測缺血區周圍Caspase-3表達假手術組僅可見少量Caspase-3陽性細胞數，對照組及阿托伐他汀組的Caspase-3陽性細胞數較相應假手術組均明顯增加，與對照組缺血72 h組相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h組的Caspase-3陽性細胞數明顯增加(圖2，表1)。

表1　各組老年大鼠凋亡及壞死率及Caspase-3、VEGFR-1陽性細胞數

與假手術組比較：1)P<0.01;與對照組比較：2)P<0.01

圖2　免疫組化染色檢測老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h的Caspase-3表達(DAB，×200)

2.4免疫組化染色檢測缺血區周圍VEGFR-1表達假手術組僅可見少量VEGFR-1陽性細胞數，對照組及阿托伐他汀組的VEGFR-1陽性細胞數較相應假手術組均明顯增加，與對照組缺血72 h相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h的VEGFR-1陽性細胞數無明顯差異(圖3，表1)。

圖3　免疫組化染色檢測老齡大鼠胡須體覺皮層缺血后72 h的VEGFR-1表達(DAB，×200)

3討論

本研究發現阿托伐他汀對老齡大鼠晚期凋亡有明顯保護作用，其與減少Caspase-3表達可能有關，同時發現該劑量的阿托伐他汀對缺血后72 h的VEGFR-1表達無明顯影響。

腦缺血后神經細胞的死亡包括缺血中心早期凋亡和半暗帶區的遲發性凋亡。細胞凋亡是細胞在生理狀態下的死亡過程，其有促進和凋亡基因共同作用。Caspase家族是目前哺乳動物凋亡的主要啟動因子，其中Caspase-3是Caspase級聯瀑布下游最關鍵的凋亡蛋白酶。正常情況下，Caspase-3參與細胞凋亡可以通過線粒體途徑和細胞表面受體途徑來發揮作用〔2〕。早期研究〔3〕表明在局灶性永久性腦缺血模型中,利用Northern印跡分析提示缺血側半球腦組織缺血后16～ 24 h,Caspase-3水平顯著增高。還有研究發現抑制Caspase-3的活化可以減輕以細胞凋亡為主要機制的缺血后遲發性細胞損害，增加存活神經元數量，縮小腦梗死體積，并改善神經功能〔4～6〕。

年齡對腦組織缺血后的凋亡及修復有著重要的影響，Davis 等〔7〕比較了成年和老齡大鼠腦組織梗死后梗死體積情況，提示老齡大鼠的梗死體積較成年大鼠體積增大，推測腦梗死的體積與增齡有關。李建生等〔8〕研究表明老齡大鼠腦缺血3 h和I/R12 h 腦梗死面積較青年大鼠增大，隨著I/R 時間延長,腦組織細胞損傷逐步加重,老齡大鼠較青年大鼠嚴重，細胞凋亡隨著I/R 時間延長而明顯增加,老齡大鼠出現的早、持續時間長。本研究藥物對老齡大鼠胡須體覺皮層永久性腦缺血模型晚期凋亡及壞死率的保護作用更符合臨床中出現的病例特征。

研究發現腦組織軸突損傷后可以修復，但修復能力較弱，可能周圍微環境影響其修復過程〔9〕。腦缺血后神經修復依賴于軸突的生長、準確的投射及突觸的形成〔10〕，其過程不僅僅需要營養因子、生長因子等調控，與軸突生長抑制因子表達有著密切的關系〔11〕。VEGF作為內皮細胞的分裂原，主要與細胞表面受體結合后促進內皮細胞的增殖、加速新生血管形成〔12,13〕。VEGF同時能夠促進軸突生長，對神經起著直接營養的作用〔14〕。VEGFR包括：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR-3(Flk-4)及神經纖維網蛋白(NP)-1和NP-2。血管內皮細胞表面主要是VEGFR-1與VEGFR-2，VEGFR-2主要是誘導血管內皮細胞增殖和分化，VEGFR-1也參與該過程。VEGFR-1的胞外部分則比VEGFR-2對VEGF具有更高的親和力，能以可溶形式存在〔15〕。VEGF主要通過VEGFR-1與VEGFR-2在內皮細胞上發揮作用〔16〕。本研究發現該劑量的阿托伐他汀對缺血后72 h的VEGFR-1表達無明顯影響，可能考慮與阿托伐他汀的劑量及作用時間有關。

他汀類藥物，即3-羥基3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一類強效降膽固醇藥物。既往研究表面阿托伐他汀鈣具有降低血脂、穩定斑塊、預防卒中復發等作用〔17,18〕。阿托伐他汀可能通過上調eNOS挽救缺血周圍區的神經細胞，通過增加腦源性神經營養因子(BDNF)、血管內皮生長因子(VEGF)的表達促進缺血后神經功能的恢復，而與血清膽固醇水平無關〔19～22〕。

4參考文獻

1Li WL,Yu SP,Ogle ME,etal. Enhanced neurogenesis and cell migration following focal ischemia and peripheral stimulation in mice〔J〕. Dev Neurobiol,2008;68(13):1474-86.

2Budihardjo I,Oliver H,Lutter M,etal. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis〔J〕. Ann Rev Cell Dev Biol,1999;15(11):269-90.

3Velier JJ,Ellison JA,Kikly KK,etal. Caspase-8 and caspase-3 are expressed by different populations of cortical neurons undergoing delayed cell death after focal stroke in the rat〔J〕. J Neurosci,1999;19(14):5932-41.

4Himi T,Ishizaki Y,Murota S. A caspase inhibitor blocks ischaemia-induced delayed neuronal death in the gerbil〔J〕. Eur J Neurosci,1998;10(2):777-81.

5Ma J,Endres M,Moskowitz MA. Synergistic effects of caspase inhibitors and MK-801 in brain injury after transient focal cerebral ischaemia in mice〔J〕. Br J Pharmacol,1998;124(4):756-62.

6Cheng Y,Deshmukh M,D'Costa A,etal. Caspase inhibitor affords neuroprotection with delayed administration in a rat model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury〔J〕. J Clin Invest,1998;101(9):1992-9.

7Davis M,Mendelow AD,Perry RH,etal. Experimental stroke and neuroprotection in the aging rat brain〔J〕. Stroke,1995;26(6):1072-8.

8李建生,任小巧,劉軻,等. 老齡大鼠腦缺血再灌注神經細胞凋亡變化規律研究〔M〕. 中國危重病急救醫學,2004;16(3):151-4.

9Ramon Y,Cajal S. Degeneration and regenration of nervous system〔M〕. London: Oxford University Press，1998：46-51.

10Rakic P. Neurobiology. Discriminating migrations〔J〕. Nature,1999;400(6):315-6.

11曾進勝,李華,洪華,等.實驗性大腦皮層梗死后丘腦和紋狀體突觸重構與抑制性蛋白表達〔J〕.中國臨床康復,2002;6(17):2534-5.

12Gao P,Shen F,Gabriel RA,etal. Attenuation of brain response to vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis and neurogenesis in aged mice〔J〕.Stroke,2009;40(11):3596-600.

13Hermann DM,Zechariah A. Implications of vascular endothelial growth factor for postischemic neurovascular remodeling〔J〕. J Cereb Blood Flow Metab,2009; 29(10):1620-43.

14Schmid-Brunclik N,Burgi-Taboada C,Antoniou X,etal. Astrocyte responses to injury: VEGF simultaneously modulates cell death and proliferation〔J〕. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2008;295(3):R864-73.

15Freitas-Andrade M,Carmeliet P,Stanimirovic DB,etal. VEGFR-2-mediated increased proliferation and survival in response to oxygen and glucose deprivation in PlGF knockout astrocytes〔J〕. J Neurochem,2008;107(3):756-67.

16Chiba Y,Sasayama T,Miyake S,etal. Anti-VEGF receptor antagonist (VGA1155) reduces infarction in rat permanent focal brain ischemia〔J〕. Kobe J Med Sci,2008;54(2):E136-46.

17Vaughan CJ,Delanty N,Basson CT. Statin therapy and stroke prevention〔J〕.Curr Opin Cardiol,2001;16(4):219-24.

18Blanco M,Nombela F,Castellanos M,etal. Statin treatment withdrawal in ischemic stroke: a controlled randomized study〔J〕. Neurology,2007;69(9):904-10.

19Asahi M,Huang Z,Thomas S,etal.Protective effects of statins involving both eNOS and tPA in focal cerebral ischemia〔J〕. J Cereb Blood Flow Metab,2005;25(6):722-9.

20Lee SH,Kim YH,Kim YJ,etal. Atorvastatin enhances hypothermia-induced neuroprotection after stroke〔J〕. J Neurol Sci,2008;275(1-2):64-8.

21Zhang L,Zhang ZG,Liu XS,etal. The PI3K/Akt pathway mediates the neuroprotective effect of atorvastatin in extending thrombolytic therapy after embolic stroke in the rat〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007;27(11):2470-5.

22Chen J,Zhang C,Jiang H,etal. Atorvastatin induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice〔J〕. J Cereb Blood Flow Metab,2005;25(2):281-90.

〔2014-12-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：無錫市科技計劃指導性項目(SCZ00N1102)；南京醫科大學科技發展基金面上項目(2011njmu023)

通訊作者：王濱(1960-)，男，碩士，主任醫師，主要從事腦血管病及神經變性病研究。

〔中圖分類號〕R743

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3128-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.015

1南京醫科大學附屬江蘇省人民醫院

第一作者：張云云 (1985-)，女，碩士，主治醫師，主要從事腦血管病研究。