T-SPOT.TB檢測結核專業人員結核潛伏感染與結核菌素皮膚試驗的對比研究

宋　韜，李莉娟，付洪義

(1.河北省胸科醫院結核內科，河北 石家莊 050041；2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院干部一科，河北 石家莊 050082)

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·論著·

T-SPOT.TB檢測結核專業人員結核潛伏感染與結核菌素皮膚試驗的對比研究

宋韜1，李莉娟2，付洪義1

(1.河北省胸科醫院結核內科，河北 石家莊 050041；2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院干部一科，河北 石家莊 050082)

[摘要]目的探討結核分枝桿菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)診斷結核專業人員潛伏結核感染(latent tuberculous infection，LTBI)的價值。方法選取85例結核內科醫護人員(結核專業人員)為研究組，另選85例健康者為對照組，2組既往均無結核病史、無結核病癥狀，胸片正常，應用T-SPOT.TB對2組進行外周血結核菌特異γ干擾素( interferon γ，IFN-γ)水平檢測，同時進行平行的結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test,TST)檢測。結果2組T-SPOT.TB陽性率差異有統計學意義，而TST陽性率差異無統計學意義。2種方法陽性率比較，研究組和對照組差異均有統計學意義(P<0.05)。一致性檢驗結果顯示T-SPOT.TB與TST一致性較差(Kappa=0.123)。結論①密切接觸傳染性結核病患者是感染結核分枝桿菌的危險因素，其成為LTBI者的概率較非密切接觸人群明顯增高；②T-SPOT.TB陽性結果與是否密切接觸傳染性結核病患者顯著相關，而TST陽性結果與是否密切接觸傳染性結核病患者無明顯相關，這可能與我國極高的卡介苗接種率有關；③T-SPOT.TB診斷LTBI特異度高于TST；④T-SPOT.TB與TST的相關性較低，它為診斷LTBI提供了新的更為準確的方法。

[關鍵詞]潛伏性結核；結核菌素試驗；診斷

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.008

潛伏結核感染(latent tuberculosis infection ,LTBI)是指宿主感染結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)后尚未發病的一種狀態[1]。我國第5次流行病學調查顯示Mtb感染者中絕大部分為LTBI[2]。LTBI人群是罹患結核病的高危人群，一旦其機體免疫能力減弱，發展為活動性結核病的可能性極高[3]。由于職業暴露的緣故，結核專業工作人員極易感染Mtb而成為LTBI者。本研究在河北省胸科醫院結核內科開展，分別采用結核分枝桿菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)和結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test,TST)檢測85名醫護人員結核分枝桿菌感染情況，并設立健康對照組，比較并分析二者的一致性，旨在探討T-SPOT.TB診斷結核專業人員LTBI的價值。

1　資料與方法

1.1一般資料選取河北省胸科醫院結核內科符合入組標準的85名醫護人員為研究組，男性10例，女性75例；年齡19～61歲，平均(33.58±10.25)歲。從本院體檢中心進行健康體檢的人群中隨機選取符合入組標準的85名設為對照組，男性46例，女性39例；年齡17～58歲，平均(33.98±10.57)歲。入組標準：①年齡≥16歲；②既往無結核病病史，無糖尿病及風濕免疫病史，無其他肺部疾病史，無艾滋病病毒感染，無妊娠，無嚴重肝腎衰竭病史，近3個月內未應用免疫抑制劑及增強劑；③目前無任何結核病的臨床表現，如咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、胸悶、氣短、午后低熱、乏力、納差、消瘦及夜間盜汗；④胸片正常；⑤簽署知情同意書。

1.2主要試劑無血清培養基：RPMI 1640，PPA laboratory Gmbh，僅用于樣本開始的處理，培養液使用結束后丟棄。AIM-VTM，Invitrogen公司，用于細胞孵育階段。PBMCs分離液：LymphoprepTM，Ads-Shield PocAS.Oslo.Norway，用于分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuckear cells，PBMCs)。無水乙醇(分析純)，上海彤晟化工科技有限公司。PBS緩沖液：1x D-PBS(catalogue number 14040-091)，美國GIBCOTM公司，用于溶解保護試劑。T-SPOT.TB試劑盒，Oxford Immunotec，Abingdon，UK，進行T-SPOT.TB的原材料包括：①微孔培養板，96(12×8)孔，由板條組成，外層披覆有無毒的小鼠抗人的干擾素γ(interferon γ ，INF-γ)單抗；②抗原A(0.8 mL/瓶)，其內含有ESAT-6抗原以及牛血清白蛋白和抑菌劑；③抗原B(0.8 mL/瓶)，其內含有CFP-10抗原以及牛血清白蛋白和抑菌劑；④植物血凝素(phytohaemagglutin,PHA)對照(0.8 mL/瓶)，其內含有用于監控細胞活性的PHA以及牛血清白蛋白和抑菌劑；⑤200倍濃縮的標記抗體(50 μL)，其內含有堿性磷酸酶標記的小鼠的抗人INF-γ單抗；⑥顯色底物溶液(25 mL)，其內含有BCIP/NBTplus；⑦結核菌素純蛋白衍生物，北京祥瑞制藥有限公司。

1.3主要儀器二級生物安全柜，美國Thermo Scientific公司。流式細胞儀，美國BD公司，進行PBMCs記數。ELISPOT分析儀，德國ADI公司，進行斑點記數。37 ℃，90%濕度，5%CO2培養箱，美國Thermo Scientific公司。4 ℃冰箱BCD-257SL，青島海爾公司。超大容量低溫離心機，美國Thermo Scientific公司。臺式振蕩器Vortex-Geniez，上海易擴儀器有限公司。電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司。新型全自動恒溫鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司。移液器，美國Thermo Scientific公司。肝素鋰真空采血管(CPT，4 mL)，美國BD公司。流式標本檢測管，美國BD公司。細胞計數板，美國HYCOR生物醫學公司。

1.4實驗方法

1.4.1T-SPOT.TB試驗①收集標本：肝素鋰真空采血管收集每位受試者2管4 mL外周靜脈血，收集之后立刻顛倒5～10次，18～25 ℃存放。標本應盡早進行檢測，不宜超過4 h。②PBMCs分離：將4 mL血液與4 mL預熱到37 ℃的RPMI 1640培養液等體積混勻；再加入4 mL預熱的Lymphoprep分離液混勻，1 800 g，18 ℃，離心處理約30 min；用吸管吸起呈牛奶色、云霧狀的PBMCs層，轉移至15 mL尖底離心管中，加入AIM-V培養液至10 mL； 600 g，離心7 min，棄去上清液；再加入1 mLAIM-V培養液使其重懸沉淀；加入AIM-V培養液至10 mL， 350 g，離心7 min；棄去上清液，將沉淀懸浮于0.7 mLAIM-V培養液中。③細胞記數和稀釋：記數活細胞后，調整細胞濃度在2.0～3.0×109/L；配制標準溶液500 μL，使其濃度達到25萬個細胞/100 μL。④培養板組裝和孵育：將培養板條嵌入培養板架內，逐漸使其恢復至室溫；分別加入50 μL培養基(陰性控制)、陽性控制、結核分枝桿菌特異抗原A和B于對應的檢測孔；每個樣本使用4個檢測孔供使用，每孔加入配制好的100 μL細胞標準溶液，于37 ℃，90%濕度2，5%CO2培養箱中孵育18 h。⑤斑點形成與記數：將培養板從培養箱端出，棄去細胞培養液；再在各個孔中加入PBS緩沖液200 μL，棄去PBS緩沖液，用吸水紙將殘留于反應孔中的液體拍干；反復用新鮮PBS緩沖液將培養板洗滌4次；用PBS緩沖液200倍稀釋濃縮標記抗體試劑；將工作酶復合物溶液50 μL置于各個孔中，6 ℃孵育1 h；再次用200 μL PBS緩沖液洗板4次；加入50 μL BCIP/NBT底物溶液至各個檢測孔中，室溫孵育7 min；蒸餾水徹底洗滌培養板，終止反應；37 ℃溫箱干燥培養板；干燥后各個反應孔內有清晰可見的深藍色的斑點，將其記數。⑥質量控制：對于一般的正常結果來說，空白對照孔應該是無或有很少的斑點，而放置有植物血凝素PHA對照孔內的斑點數應該≥20個；當空白對照孔內的斑點數≥10個時，為“不確定”結果。還有一種檢測結果被認為是“不確定”結果，即當放置有細胞活性PHA對照孔內的斑點數≥20個或反應孔內遍布斑點(斑點數量太多)，而放置有PHA對照孔內的斑點數應該<20個時。對此情況的解釋是絕大多數人群的T細胞對PHA有反應。除非能把抗原A孔或抗原B孔中的斑點數作依據結果解釋和判斷標準確定為有“反應性”，才能說明結果有效。基于生物科學和反應體系的原因，當空白的對照孔內的斑點數≤5個，并且抗原A孔內斑點數減去空白對照孔斑點數或抗原B孔內斑點數減去空白對照孔斑點數的結果在5～7之間時，也被認定為“不確定”結果。此時應當根據受試者所有相關的臨床資料進行判斷，如有必要，可再次進行復查。雖然ESAT-6和CFP 10抗原的特異性很高，在所有牛性分枝桿菌(包括卡介苗)以及絕大部分非結核分枝桿菌都不存在，但當受試者感染海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、轉黃分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、胃分枝桿菌時，T-SPOT.TB檢測有可能出現“假陽性”結果。若懷疑受試者為上述細菌感染時，需要進行相關的鑒別診斷。結果判定，目視法判定標準：①陽性對照孔內斑點數≥20個視為試驗有效；②陰性對照孔內斑點數為≤5個，A孔內斑點數或B孔內斑點數-陰性孔斑點數≥6個，認定結果為陽性；③若陰性對照孔內斑點數≥6個，A孔內斑點數或B孔內斑點數≥陰性孔斑內點數×2，認定結果為陽性；④若A孔內斑點數或B孔內斑點數的數量<20，且陽性對照孔內斑點數≥20個，認定結果為陰性。

1.4.2TST由在結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative tuberculin，PPD)試驗室工作5年以上的專業護士進行操作，用PPD 5 U，在研究對象左前臂屈側做皮內注射，72 h后觀察結果。結果判定：在室內自然光線下，用食指和中指輕摸腫硬程度，然后用米度尺測量硬結的平均直徑(縱徑和橫徑相加再除以2)，測量時以垂直的最大縱徑和最大橫徑為標準。①陰性：無反應或輕微紅潤，硬結平均直徑在5 mm以下；②一般陽性：硬結平均直徑在5～19 mm，且無水泡、壞死及淋巴管炎；③強陽性：硬結平均直徑≥20 mm或不論硬結平均直徑大小，出現水泡、壞死及淋巴管炎[4]。

1.5統計學方法應用SPSS 18.0軟件進行統計學處理。計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。T-SPOT.TB與TST的一致性分析應用Kappa檢驗測量評估，Kappa值≥0.75，二者一致性較好；Kappa值<0.4，二者一致性較差。

2　結　　果

2組T-SPOT.TB陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，而TST差異無統計學意義。2種方法陽性率比較，研究組和對照組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

一致性檢驗結果顯示T-SPOT.TB與TST一致性較差(Kappa=0.123)。

表1　2組T-SPOT.TB與TST陽性率比較Table 1　The positive rates of T-SPOT.TB group and TST group　(n=85，例數，%)

3　討　　論

結核病是慢性呼吸道傳染病，它嚴重危害著人體的健康和公共衛生安全，是全世界都在努力遏制和重點防控的傳染病之一，而結核病感染控制是全球結核病控制的一項難題。據世界衛生組織調查全球約20億人感染Mtb，絕大部分為LTBI[5]。LTBI是機體感染Mtb未被清除但不表現出任何臨床癥狀的一種特殊狀態，當機體免疫功能下降的時候，休眠的Mtb被喚醒、繁殖，從而發展成為活動性肺結核病[6]。可見LTBI不是簡單的細菌暫停生長狀態，而是與宿主免疫系統的動態平衡[7]。因此，如何快速而準確地診斷LTBI，如何采取有效的檢測方法及早發現LTBI者，并加以早期干預，減少其發展為結核病患者的概率，是結核病防控的關鍵，對結核病的防控意義重大。目前我國尚無診斷LTBI的標準，臨床上僅以TST陽性而無活動性結核病的臨床表現和影像學改變為判斷依據[8]。由于TST應用的PPD是數百種抗原的混合物，與卡介苗及多種非結核分枝桿菌有交叉性抗原，在我國這樣一個卡介苗高接種率的國家，存在很高的假陽性[9]。自2010年以來T-SPOT.TB在我國飛速發展，文獻顯示其對結核菌的特異度及敏感度均達到80%以上[10]，尤其對診斷LTBI特異度更高，大有取代TST之勢。本研究對此進行了初步的探討。

本研究結果顯示結核科醫護人員T-SPOT.TB陽性率為43.5%，提示LTBI明顯高于健康人群的4.7%，可見密切接觸傳染性結核病患者是感染Mtb的危險因素。結核科是結核病患者尤其是高傳染性肺結核患者高度集中、頻繁活動的場所，極易造成病患與醫護人員之間的感染傳播，有資料顯示我國醫務人員結核分枝桿菌感染率在50%～70%之間，年均患病率在415/10萬～2240/10萬之間[11]。鑒于目前的國情，我國大部分結核防治機構硬件設施不完善，這增大了結核科醫護人員感染Mtb的風險。張忠順等[12]利用T-SPOT.TB檢測結核病防治專業人員Mtb潛伏感染情況，結果顯示我國基層醫務工作者尤其是結核病防治專業人員受Mtb潛伏感染的危險性高，且與接觸時間成正比。醫務人員被感染結核菌，一旦發病后果較嚴重，因為醫務人員經常與結核病人接觸，感染的Mtb不僅僅敏感菌，還有一部分是耐藥菌，尤其是耐多藥結核菌或是廣泛耐藥結核菌，對自身健康損害極大。我國分別于2010年和2012年發布了《中國結核感染預防控制手冊》和《中國結核感染控制標準操作程序》，開展對醫務人員Mtb感染控制宣教，加大感染控制經費投入等，但現有數據表明我國大部分地區目前未能開展規范化培訓和Mtb感染控制[13]。因此，國家制定并及時補充有效的防范政策及措施，各個醫療機構(尤其是結核病專業防治機構)切實的貫徹和執行，每個人防范意識的提高是保護我們不成為LTBI者的堅實之盾。

本研究結核科醫護人員TST陽性率與健康人群組無明顯差異。這可以歸因于我國從上世紀50年代就對新出生的嬰兒常規接種卡介苗，而TST所應用的PPD成分不單一，是200多個抗原的粗提純物，它與卡介苗及多種非結核分枝桿菌共享多個抗原表位，使TST特異度有限，故TST會導致一定數量的“假陽性”結果。

本研究中T-SPOT.TB顯示結核科醫護人員LTBI陽性率明顯低于TST，而T-SPOT.TB顯示健康人群LTBI陽性率明顯低于TST。可見T-SPOT.TB診斷LTBI較TST有更高的特異度。這得益于ESAT-6和CFP-10作為抗原，二者編碼來源于結核分枝桿菌基因中的一個菌種特異性基因片段。這個基因片段不存在于大部分的非結核分枝桿菌以及所有的牛型分枝桿菌(包括卡介苗)中[14]。研究顯示，T-SPOT.TB在診斷Mtb感染方面比TST有更高的特異度，WHO也強烈推薦T-SPOT.TB在部分資源條件許可的高收入和中高收入國家用于檢測LTBI[15]。

本研究一致性分析結果顯示T-SPOT.TB與TST的一致性較差，這可以歸因于T-SPOT.TB診斷準確性的提高和由于我國廣泛接種卡介苗而導致的TST診斷準確性下降。

綜上所述，密切接觸傳染性結核病患者是感染Mtb的危險因素，其成為LTBI者的概率較非密切接觸人群明顯增高；T-SPOT.TB陽性結果與是否密切接觸傳染性結核病患者顯著相關，而TST陽性結果與是否密切接觸傳染性結核病患者無明顯相關，這可能與我國極高的卡介苗接種率有關；T-SPOT.TB診斷LTBI的特異度高于TST；T-SPOT.TB與TST的相關性較低，它為診斷LTBI提供了新的更為準確的方法。

本研究的不足之處：結核專業組與健康人群組性別不匹配，結核病專業人員以女性居多，但T-SPOT.TB與性別分布關聯較小，故未做校正；由于實際條件所限，研究樣本量較小，且不同的醫院、不同的科室由于管理方法的不同，Mtb的感染率亦會不同，故更具說服力的調查應在多家不同的醫院進行，并進一步擴大樣本量，以求得出更完善的結論。

[參考文獻]

[1]中華醫學會結核病分會,《中華結核和呼吸雜志》編輯委員會.γ-干擾素釋放試驗在中國應用的建議[J].中華結核和呼吸雜志,2014,37(10):744-747.

[2]全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組,全國結核病流行病學抽樣調查辦公室.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志,2012,34(8):485-508.

[3]吳雪瓊,梁艷,王國志.γ-干擾素釋放試驗臨床應用的價值、問題與展望[J].中國防癆雜志,2015,37(7):722-727.

[4]唐神結,高文.臨床結核病學[M].北京:人民衛生出版社，2011:80-81.

[5]Zumla A,George A,Sharma V,et al. WHO′s 2013 global report on tuberculosis:successes,threats,and opportunities[J]. Lancet,2013,382(9907):1765-1767.

[6]Kondratieva T,Azhikina T,Nikonenko B,et al. Latent tuberculosis infection:what we know about its genetic control?[J]. Tuberculosis(Edinb),2014,94(5):46246-46248.

[7]吉萍,范小勇,吳康,等.結核分枝桿菌潛伏感染相關抗原的研究進展[J].中華微生物學和免疫學雜志,2015,35(1):59-64.

[8]陳友鵬,黃思敏.潛伏結核感染的研究新進展[J].新醫學,2008,39(12):820-821.

[9]史玲莉.免疫學方法診斷結核病的研究進展[J].河北醫科大學學報，2013,34(11):1475-1480.

[10]Dai Y,Feng Y,Xu R,et al. Evaluation of interferon-gammarelease assays for the diagnosis of tuberculosis：an updated metaanalysis[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(11):3127-3137.

[11]耿夢杰,宋渝丹,趙飛,等.國內外醫務人員結核感染控制現狀的比較研究[J].中國防癆雜志,2013,35(8):581-586.

[12]張忠順,樓海,肖和平.結核病專業人員及密切接觸者結核潛伏感染的研究[J].中國防癆雜志,2011,32(1):36-40.

[13]潘麗萍,賈紅彥,張宗德. 醫務人員結核分枝桿菌潛伏感染的相關問題[J].中華結核和呼吸雜志,2016,39(1):16-20.

[14]Drobniewski F,Cobelens F,Zellweger JP,et al. Use of Gamma-interferon assays in low-and medium-prevalence countries in Europe: a consensus statement of a Wolfheze Workshop organised by KNCV/EuroTB,Vilnius Sept 2006[J]. Euro Surveill,2007,12(7):E070726.2.

[15]方勇,肖和平. 潛伏性結核感染的診治進展[J].中國防癆雜志,2016,38(2):36-40.

(本文編輯：劉斯靜)

[收稿日期]2015-10-21；[修回日期]2015-11-15

[基金項目]河北省醫學科學研究重點課題(1020140373)

[作者簡介]宋韜(1980-)，男，河北石家莊人，河北省胸科醫院主治醫師，醫學碩士，從事結核疾病診治研究。

[中圖分類號]R52

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)07-0772-05

A comparative study of applying T-SPOT.TB and TST in the diagnosis of LTBI in TB professionals

SONG Tao1, LI Li-juan2, FU Hong-yi1

(1.Department of TB Medicine， Hebei Chest Hospital， Shijiazhuang 050041， China；2.First Department of Cadre's Ward, Bethune International PeaceHospital of Chinese PLA， Shijiazhuang 050082， China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the value of T-SPOT.TB in the diagnosis of latent tuberculous infection (LTBI) in TB professionals. MethodsEight-five cases of TB medical staff as TB professionals were selected. Eight-five cases of healthy people were selected for control group, all without previous TB history or symptoms and with normal chest film. Apply T-SPOT.TB was detected by the specific interferon γ (IFN-γ)level of the peripheral blood. Tuberculin skin test(TST) was used also. TB bacillus while carrying out parallel TST tests. ResultsT-SPOT.TB results show that the difference between the study group and the control group was statistically significant. TST indicates that there is no statistic difference between the 2 groups. The positive rate comparison of the two methods shows that there is statistic difference between the 2 groups(P<0.05). Consistency check indicates that there is poor consistency between the two test methods (Kappa=0.123). Conclusion①Closely contacting with TB infected patients is a risk factor which leads to MTB infection. People with close contact have a higher rate of becoming LTBI patients than those without close contact. ②T-SPOT.TB positive results are positively correlated with those who closely contact with TB infected patients, while TST positive results are not correlated, probably due to a very high BCG vaccination rate in China. ③T-SPOT.TB has a higher specificity than TST in LTBI diagnosis. ④T-SPOT.TB has a low correlation with TST and serves as a more accurate method of LTBI diagnosis.

[Key words]latent tuberculosis； tuberculin test； diagnosis