血清TTR的表達與結直腸癌轉移的相關性研究

徐靜　張洪柱　徐玉芬

[摘要] 目的 研究分析結直腸癌轉移與血清轉甲狀腺素蛋白（TTR）表達之間的相關性。 方法 選擇2014年1月～2015年12月間我院收治的23例結直腸癌患者進行本次研究，采集其血液樣本。根據是否出現了遠處轉移進行分組，將其中無遠處轉移的樣本設為對照組，共11例；發生遠處轉移的樣本設為觀察組，共12例。所有樣本都采用蛋白免疫印跡方法對TTR 表達進行半定量分析。 結果 通過計算兩組樣本的光密度比值，結果顯示無遠處轉移的結直腸癌患者血清樣本（對照組）中TTR的表達量更高，顯著高于發生遠處轉移患者（觀察組）血清TTR表達量，差異有統計學意義（P=0.023<0.05）。 結論 結直腸癌患者血清TTR的表達水平與腫瘤是否發生轉移有相關性，發生遠處轉移結直腸癌患者血清TTR表達量顯著更低，在今后對結直腸癌浸潤與轉移水平的評估中，TTR可作為一種腫瘤標志物。

[關鍵詞] 血清TTR；結直腸癌；相關性；表達水平

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）30-0016-04

轉甲狀腺素蛋白（TTR），也被稱為“前白蛋白”，英文簡稱PA，是由4個相同亞基共同構成的一種四聚體，每個亞基由127個氨基酸組成，其主要功能是以轉運蛋白的身份參與轉運甲狀腺素、視黃醇，同時TTR還能夠體現體內蛋白的合成情況，當體內蛋白丟失，出現應激狀態時，TTR水平會迅速下降，反之則增高[1]。由于TTR是一種甲狀腺素與視黃醇的轉運蛋白，所以其表達情況可體現機體的營養及某些病理改變，可作為預測疾病、判斷疾病預后的一項指標[2]。為此，我院選取2014年1月～2015年12月間所收治的結直腸癌住院患者進行研究，分析發生遠處轉移與未發生遠處轉移患者TTR的表達情況，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2014年1月～2015年12月結直腸癌住院患者23例為研究對象，所有患者均經病理確診，經檢查均未發現其他惡性腫瘤與甲狀腺代謝疾病。采集血清樣本，其中11例患者未出現遠處轉移，12例患者伴有遠處轉移（均屬于肝或者胃轉移），患者年齡最小48歲，最大79歲，平均（69.1±3.1）歲，其中男12例，女11例。全部患者于術前采集血清樣本，術前均未進行放射治療、化療與免疫治療，全部患者臨床資料均齊全。血清樣本均置于-80℃保存，采用全自動生化儀對血清蛋白濃度進行檢測。

1.2方法

對23例患者血清采用蛋白免疫印跡半定量檢測。①吸取30 μL血清標本，采用SDS-PAGE，變性溫度設置為100℃，處理時間設置為18 min。②電泳濃縮膠電壓設置為60 V，分離膠電壓設置為120 V。90 min半干電轉儀轉膜，采用封閉液進行封閉，封閉液采用5%脫脂奶粉+PBST；封閉一抗，封閉液采用抗體稀釋劑，TTR抗體：封閉液=1∶1000，β-actin抗體：封閉液=1∶400，在4℃下過夜；PBST：0.05% Tween+PBS，每20分鐘對膜進行一次清洗，共清洗3次。封閉二抗，TTR抗體與β-actin抗體分別采用山羊抗兔（LgG H+L）辣根過氧化物酶抗體與山羊抗小鼠（LgG H+L）辣根過氧化物酶抗體，其中TTR抗體：封閉液=1∶1500，β-actin抗體：封閉液=1∶2000，將其放置在溫室搖床孵育，時間設置為90 min，PBST每15分鐘進行一次洗膜，共進行3次，采用DBA顯色液對膜顯色5 min[3]。然后采用分析軟件Image J進行條帶光密度的計算和分析。

1.3統計學處理

采用SPSS 21.0統計學軟件對獲得的計量資料、計數資料進行統計處理，伴有遠處轉移組與未發生遠處轉移組的計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，顯著水平95%，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 有遠處轉移與無遠處轉移組患者血清TTR的表達結果比較

采集11例未發生遠處轉移的結直腸癌患者血清，實驗以5或6例為一組，采用Western blotting雜交實驗對血清中的TTR 進行測定，實驗以β-actin 為內參，結果見圖1。同樣方法，運用雜交實驗半定量分析12例發生遠處轉移結直腸癌患者血清中TTR表達，結果見圖2。

2.2遠處轉移與無遠處轉移組結直腸癌患者血清TTR半定量結果比較

比較遠處轉移與無遠處轉移組結直腸癌患者血清TTR 與β-actin光密度值，β-actin 為參考標準，對比分析兩類患者血清TTR的表達量相對變化，同時計算TTR 的變化相對比率。統計學分析顯示，比較發生遠處轉移結直腸癌患者（觀察組）與未出現遠處轉移結直腸癌患者（對照組）血清中TTR 的表達量，前者為（3.6±0.8），后者為（11.4±3.5），發生遠處轉移結直腸癌患者血清TTR表達量顯著更低，二者差異有統計學意義（t=7.524，P=0.023<0.05）。

3 討論

轉甲狀腺素蛋白（TTR）也被稱為前白蛋白（PA），合成于肝臟與脈絡叢，負責轉運人體內甲狀腺素、視黃醇蛋白并參與維生素A 的代謝。甲狀腺結合前清蛋白，屬于血漿運輸蛋白，主要負責轉運維生素A與蛋白和甲狀腺素結合。甲狀腺結合前清蛋白主要于肝臟、眼睛和脈絡膜中產生，在人體血漿及腦脊髓液中有分布[4]。在pH=7.2的生理條件與環境下，TTR是一種穩定的蛋白質，其基本結構及其功能均是穩定的[5]。當TTR發生分解成為單體后，將會導致淀粉變性病[6]。與正常人血清中TTR表達量比較，惡性腫瘤患者血清中的TTR表達量往往體現為低表達。相關研究結果表明，與正常人相比，在肝癌、肺癌患者中TTR表達呈下降態勢[7-8]，所以，在惡性腫瘤中TTR 基因具有抑癌基因的作用。通過查閱大量的文獻資料，有關惡性腫瘤TTR表達的研究報道指出，在惡性腫瘤的發生與發展的過程中，TTR起到了腫瘤抑制物的作用，對腫瘤有抑制作用[9-10]。國外相關研究報道指出，通過對比結直腸癌患者與正常人的血清蛋白差異點，結果顯示二者在TTR 的表達上存在顯著的差異，但對比CEA陰性與陽性患者血清蛋白差異點，結果顯示并無顯著性差異[11-12]。在結直腸癌的診斷中，TTR可作為標志物，研究顯示，血清蛋白優勢更加明顯。當前在惡性腫瘤的分期和分級中，有關TTR的報道較少，有關研究指出結直腸癌患者出現淋巴轉移的與未出現淋巴轉移的TTR表達量并沒有顯著差異[13-14]。上述研究結果顯示，TTR基因具有抑制癌癥的作用，而結直腸癌的發展與TTR表達存在一定的聯系，并且不同分期中TTR蛋白的表達存在明顯的差異，預示著TTR的診斷價值。

本研究選擇2014年1月～2015年12月我院所收治的結直腸癌患者作為研究對象，實驗結果表明，對比沒有出現遠處轉移結腸癌患者血清中的TTR表達，出現遠處轉移結直腸癌患者血清中TTR的表達呈明顯下降態勢，對比分析兩類患者血清TTR的表達量相對變化，計算TTR 的變化相對比率。遠處轉移結直腸癌患者TTR 的變化相對比率為（3.6±0.8），與未出現遠處轉移結直腸癌患者TTR 的變化相對比率（11.4±3.5）比較顯著更低，此結果提示對TTR表達水平的研究可作為一種重要的標志物來推斷結直腸癌的發生與進展[15-17]。

TTR參與到甲狀腺素、視黃醇的轉運當中，目的在于保證體內甲狀腺素、視黃醇以及結合蛋白水平處于正常水平[18]。TTR有很多種突變體，突變體的存在會造成多種疾病發生，其與細胞本身的變異、疾病的發生與發展緊密相關。現階段大部分惡性腫瘤的治療的關鍵就在于早期診斷，這對腫瘤研究起著巨大的作用。結合國內外相關研究，主張TTR檢測可對多種惡性腫瘤進行預測，因此被認定是一種良好的標志物，用于惡性腫瘤的診斷具有很高的價值[19]。當前其他腫瘤相關研究并未提及惡性腫瘤在TTR基因結構上存在異常，用于體外轉染癌細胞是否能夠抑制其生長并無定論，且對TTR具體影響腫瘤的機制也尚待研究[20-21]。當前針對TTR與腫瘤發生、發展關系的研究樣本數量并不多，結果也有待進一步的研究，通過對TTR及其突變體在腫瘤中的作用機制研究，可對該基因多態性病因學更好地做出闡述[22]。由于TTR存在部分突變體，當這些突變體發生變化時將可能對診斷的準確性造成一定的影響，造成結果不準確，這也是需要進一步探討的問題。當前測定總體TTR含量可采用電流測定，同時酶聯免疫法測定TTR技術也逐漸得到應用推廣，測定技術變得更加成熟，而測定結果也更加穩定，特異性也顯著提高，因此進一步開展對TTR表達的研究可使臨床腫瘤測定結果穩定性和特異性也進一步提高，相信深入開展TTR 對于臨床腫瘤的診斷具有非常重要的意義和發展前景。

綜上所述，結直腸癌患者血清TTR的表達水平與腫瘤是否發生轉移有相關性，發生遠處轉移結直腸癌患者血清TTR表達量顯著更低，在今后對結直腸癌浸潤與轉移水平的評估中，TTR可作為一種腫瘤標志物。

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（收稿日期：2016-06-24）