復方芪鷹顆粒對糖尿病周圍神經病變大鼠Hsp70表達的影響

劉濤+盧軍+石瑩瑩

[摘要] 目的 觀察復方芪鷹顆粒對糖尿病周圍神經病變（DPN）大鼠坐骨神經Hsp70表達及坐骨神經損傷纖維的影響，探討其機制。 方法 從60只Wistar大鼠中隨機取出10只為正常組，50只大鼠造DPN模型，將成模43只大鼠隨機分為模型組（11只）、復方芪鷹顆粒低劑量組（11只）、復方芪鷹顆粒中劑量組（11只）、復方芪鷹顆粒高劑量組（10只），實驗過程中，模型組死亡3只，復方芪鷹顆粒低劑量組死亡1只。復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組分別為1.17、2.34、4.68 g/kg，模型組、正常組均灌以相應容積的蒸餾水，1次/d。治療4周后，觀察各組Hsp70表達、坐骨神經損傷纖維變化。 結果 復方芪鷹顆粒各劑量組及模型組坐骨神經中Hsp70表達與正常組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；復方芪鷹顆粒中、高劑量組坐骨神經中Hsp70表達與模型組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01），而中劑量及高劑量組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；復方芪鷹顆粒各劑量組及模型組與正常組在在坐骨神經損傷纖維百分比方面比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組與模型組在坐骨神經損傷纖維百分比方面比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 復方芪鷹顆粒可能通過調節DPN大鼠坐骨神經Hsp70水平，從而改善受損坐骨神經。

[關鍵詞] 復方芪鷹顆粒；中藥復方；糖尿病周圍神經病變；Hsp70

[中圖分類號] R259 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（a）-0028-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Compound Qiying Granule on the expression of Hsp70 and the injury of sciatic nerve in sciatic nerve of rats with diabetic peripheral neuropathy （DPN） and explore its mechanism. Methods From 60 Wistar rats， 10 rats were taken randomly as normal group， 50 rats were made DPN model， the model of 43 rats were randomly divided into model group （n=11）， low dose group of Compound Qiying Granule （n=11）， medium dose group of Compound Qiying Granule （n=11）， high dose group of Compound Qiying Granule （n=10）， in the course of the experiment， 3 rats died in the model group，1 rat died in low dose group of Compound Qiying Granule. The dose of low， middle and high group were 1.17， 2.34 and 4.68 g/kg respectively. Normal and model groups were given equal volume of distilled water once daily. After 4 weeks treatment， the expression of Hsp70 and the change of sciatic nerve fiber damage were observed. Results The expression of Hsp70 in each dose Compound Qiying Granule group and model group compared with the normal group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the expression of Hsp70 in medium and high dose groups of Compound Qiying Granule compared with the model group， the difference was statistically significant respectively （P < 0.01）， and had no significant difference between medium dose and high dose group （P > 0.05）. The sciatic nerve fiber percentage in each dose Compound Qiying Granule group and model group compared with the normal group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the sciatic nerve fiber percentage in low， medium and high dose group of Compound Qiying Granule compared with the model group， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion The Compound Qiying Granule can improve the Hsp70 of sciatic nerve in DPN rats and improve the injured sciatic nerve.

[Key words] Compound Qiying Granule； Chinese herbal formula； DPN； Hsp70

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病的常見并發癥，與周圍神經軸突萎縮、脫髓鞘、再生障礙以及神經纖維的減少有關[1-2]，其確切發病機制尚不完全清楚[3]。Yorek[4]認為，DPN是一種常見的以神經退行性病變為特點的糖尿病并發癥，多種病理機制參與致病，所以很難單一用藥物控制。研究發現，調節分子伴侶Hsp70活性的藥物能夠通過提高DPN的感覺功能、綜合電生理、生化和形態指標等方面來達到廣泛的細胞保護作用[5]。復方芪鷹顆粒作為新疆維吾爾自治區中醫醫院（以下簡稱“我院”）院內制劑，被廣泛應用于DPN的治療中。前期實驗及臨床研究顯示，該藥能加快感覺及運動神經傳導速度，升高血清中血管內皮生長因子水平，降低血清同型半胱氨酸水平，增加Na+/K+-ATP酶的活性及胰島素樣生長因子-1水平等多方面的作用，從而減輕患者臨床癥狀[6-11]。因此，基于該藥的多靶點特性，本課題通過研究復方芪鷹顆粒對DPN大鼠分子伴侶Hsp70調節，揭示其對DPN的治療途徑與作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重130～170 g，由新疆維吾爾自治區疾病控制中心提供。許可證號SCXK新2005-006。

1.2 實驗藥物

復方芪鷹顆粒，由我院研制，批號ZJ2012006。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ）購于Sigma公司、Hsp70抗體（Sigma公司），SP-9000免疫組化試劑及DAB顯色劑（中杉金橋）、PBS、TBS緩沖液（Boster公司）。石蠟切片機（Rm-2135型，德國Leica公司）；光學顯微鏡，CX21型，日本奧林巴斯公司。顯微成像系統，DM-500，德國萊卡公司。血糖儀，4297A型，臺灣博士醫生。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型

1.4.1.1 2型糖尿病模型 造模過程參考本課題組前期工作[11]。造模大鼠持續喂以高脂飼料（其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%豬油）8周。8周后，大鼠禁食14 h后腹腔注射小劑量STZ 35 mg/kg（STZ溶于0.1 mol/L，pH=4.5的枸櫞酸緩沖液，配制為1%的溶液）進行造模。之后監測大鼠空腹血糖，選取空腹血糖高于11.1 mol/L的大鼠作為糖尿病模型大鼠。

為防止糖尿病大鼠因血糖過高而無法存活至實驗終點，根據所測得的血糖水平予以精蛋白鋅胰島素注射液1～4 U，1 次/d，皮下注射，維持血糖在20.0～25.0 mmol/L（糖尿病組及各治療組均有此情況）。

1.4.1.2 DPN大鼠模型 在2型糖尿病大鼠的基礎上繼續高脂飲食4周，之后應用Meditronic keypoint-4 workstation肌電圖儀測定糖尿病大鼠下肢坐骨神經的感覺和運動傳導速度，糖尿病大鼠造模成功后測定感覺或運動傳導速度減慢超過11%，即可判定為成功的DPN大鼠模型[12-13]。

1.4.2 分組與給藥

從60只8周齡大鼠中隨機取10只為正常組；50只造模，造模成功43只，隨機分為4組：模型組（11只）、復方芪鷹顆粒低劑量組（11只）、復方芪鷹顆粒中劑量組（11只）、復方芪鷹顆粒高劑量組（10只）。

復方芪鷹顆粒治療組（1.17、2.34、4.68 g/kg，用純水分別配為8.45%、16.9%、33.8%的溶液），模型組、正常組均灌以相應容積的蒸餾水，1次/d，每次2 mL灌胃。連續用藥4周，實驗期間全部大鼠予普通飼料喂養，自由進食和水。

1.4.3 留取標本

所有實驗大鼠均在用藥4周后處死。將大鼠予10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，俯臥位固定于手術臺上。開腹、開胸暴露心臟，將針頭經心尖處插進左心室，剪開右心耳，給予37℃生理鹽水灌流，直至流出液無色為止。繼續給予4℃、4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液40 mL左右灌流固定，直至大鼠身體變硬為止。固定脊椎，于股骨干后外側剪開股二頭肌與半膜肌之間的皮膚，于大鼠股外側肌間隙進入，并沿兩股間鈍性分離，暴露坐骨神經，沿坐骨神經向腰椎內將神經用力拉出，找到膨大的背根神經節，用銳利刀片切取神經節組織，留取坐骨結節至遠端脛腓神經分叉處的坐骨神經。將組織置于凍存管內，-80°凍存，備用。

1.4.4 檢測指標

1.4.4.1 Hsp70表達測定 Hsp70的免疫組化及平均光密度測定參考文獻[14-15]。

1.4.4.2 大鼠坐骨神經損傷纖維 取大鼠左側從坐骨結節至遠端脛腓神經分叉處的坐骨神經，4%甲醛固定，并逐級酒精脫水，12 h后取出，蠟塊包埋，切片，Kullshitzky髓鞘染色法染色，用光鏡觀察坐骨神經髓鞘的病理變化及藥物的影響。在每一神經標本縱切片上觀察25根有髓神經纖維，計數發生神經病變（結周脫髓鞘、磷脂過度皺褶、結間隙增多、節段性脫髓鞘、髓鞘發生潰變/Wallerian變性）的纖維，計算其占總纖維數的百分率。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析，各組實驗數據用均數±標準差表示，方差齊時采用t檢驗；方差不齊時用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況

正常組大鼠的一般狀況良好，模型組大鼠出現消瘦、多食、多尿癥狀，各治療組大鼠在實驗過程中，癥狀均較模型組大鼠輕。在實驗期間，模型組死亡3只，復方芪鷹顆粒小劑量組死亡1只。

2.2 各組坐骨神經Hsp70表達水平的比較

復方芪鷹顆粒各劑量組及模型組大鼠坐骨神經Hsp70表達與正常組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；復方芪鷹顆粒中、高劑量組大鼠坐骨神經Hsp70表達與模型組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01），而復方芪鷹顆粒中劑量及復方芪鷹顆粒高劑量組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.3復方芪鷹顆粒對大鼠坐骨神經損傷神經纖維的影響

復方芪鷹顆粒各劑量組及模型組坐骨神經損傷纖維百分比與正常組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組坐骨神經損傷纖維百分比與模型組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

3 討論

Hsp70是一個重要的神經保護分子伴侶，其蛋白結構主要包括一個N端約450個氨基酸殘基的高度保守的ATPase功能域和一個C端約200個氨基酸殘基的相對保守的區域（肽鏈結合區），主要是通過幫助蛋白質復性的作用機制，減少神經退行性疾病[16]。在應激條件下，Hsp70可快速轉移至細胞核、核仁等附近區域，并可經細胞質進入細胞核，與變性蛋白疏水區結合，限制其相互聚合并解聚已聚合蛋白，恢復正常三級結構。研究表明，Hsp70主要通過抑制炎癥信號通路（核因子-κB）而抑制腦內炎癥反應，從而發揮保護神經元的作用[17]。盡管DPN的病因沒有與某一個特定的錯誤折疊或聚集蛋白聚合相關，高血糖會增加氧化應激，氨基酸的氧化修飾，可妨礙蛋白質折疊，降低線粒體功能和蛋白導入，增強與分子伴侶的相互作用[18-19]。分子伴侶的調節可以改善DPN中因營養受損的周圍神經的胰島素信號[20]。因此，調節分子伴侶Hsp70對于治療DPN有重要作用。

復方芪鷹顆粒是胡曉靈主任醫師根據中醫理論，結合DPN的特點，長期應用于臨床，療效顯著[6-10]。它是以消渴為本，痿痹為標，以氣陰兩虛、痰瘀阻滯、風伏絡瘀為根本病機，以益氣養陰、祛瘀化痰、疏風通絡為法組方，精選黃芪、黃精、鷹嘴豆、丹參、蟬蛻五味中藥。君藥黃芪甘而微溫，歸脾肺經，功擅補中益氣健脾，向為補氣之主將。《別錄》謂其“補丈夫虛損，五勞贏瘦，止渴”；《日華子本草》稱其可“助氣，壯筋骨，長肉，補血”。由是觀之，黃芪之補氣，本可生津以療消渴，亦可養血生肌壯筋以起痿癥，又能祛風調營達衛而治痹癥。臣藥黃精甘平，歸脾肺腎經，功可補氣養陰，健脾潤肺益腎。《日華子本草》稱之可“補五勞七傷，助筋骨，生肌，耐寒暑，益脾胃，潤心肺”；《本草綱目》謂其“補諸虛……填精髓”。本品不僅能補益肺腎之陰，而且能補益脾氣脾陰，常與黃芪合用，治療氣虛津虧之消渴。臣藥鷹嘴豆性味甘平，無毒，具有補中益氣、溫腎壯陽、活血解毒、潤肺止咳等作用。維吾爾語稱之為“諾胡提”，在阿維森納《醫典》及《膳食正要》《本草拾遺》等典籍中均有記述，是藥食兼用珍品。本方選用鷹嘴豆，一者與黃精相伍，協助君藥，共奏補中益氣之功，用作臣藥；兩者與丹參相合，助其通行血脈之力，兼充佐藥之職。佐藥丹參苦微寒，歸心肝心包經，功可活血祛瘀止痛，涼血消癰，除煩安神。本品善能通行血脈，祛瘀止痛，廣泛應用于各種瘀血病證。因其性偏寒涼，對血熱瘀滯之證尤為相宜。佐藥蟬蛻甘寒，歸肺肝經，功可疏散風熱，息風止痙。《本草綱目》謂其“治頭風眩運，皮膚風熱，痘疹作癢，破傷風及疔腫毒瘡，大人失音，小兒噤風天吊，驚哭夜啼，陰腫”。本品甘寒入肺經，可祛肺經風熱，入肝經，可通絡止痙。《外科正宗》消風散治風濕浸淫肌膚血脈，皮膚瘙癢，即用本品疏散肌膚風邪。復方芪鷹顆粒取蟬蛻為佐藥，蓋以消渴痿痹風邪伏于四肢肌膚絡脈之內，非輕清疏達之品不辦，蟬蛻性能功治，正可當之。現代藥理研究發現，黃精、黃芪、丹參、蟬衣、鷹嘴豆對本病均有一定的治療作用。

本實驗研究發現，復方芪鷹顆粒中、高劑量組與模型組在大鼠坐骨神經的Hsp70表達方面比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01），而中劑量及高劑量間比較差異無統計學意義（P > 0.05），提示復方芪鷹顆粒能夠提高Hsp70的水平。而對于坐骨神經損傷纖維的影響，復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組與模型組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01），提示復方芪鷹顆粒具有減少坐骨神經損傷纖維作用，其原因可能與該藥能夠提高Hsp70的表達有關。Hsp70的表達上調能夠防止神經細胞凋亡[21]，減少神經退行性疾病的氧化應激反應[22]。最近研究支持Hsp70的表達可以通過加速c-Jun的蛋白酶體降解，防止神經調節蛋白1（NRG1）誘導周圍神經的脫髓鞘[23]。而Kirkegaard等[24]報道，Hsp70可通過穩定溶酶體膜，阻止溶酶體蛋白酶釋放入胞漿，從而抑制經溶酶體通路誘導的細胞凋亡。因此，Hsp70對于神經的保護不僅因為分子伴侶的作用，還有其抑制凋亡的作用。該藥物具體機制可能是高表達的Hsp70幫助受損周圍神經細胞中錯誤蛋白質的折疊發揮了分子伴侶的作用，改善了線粒體功能，阻止了細胞凋亡，修復了受損的周圍神經的胰島素信號傳導[18-19]，防止了周圍神經軸突萎縮、脫髓鞘、再生障礙，從而達到治療DPN的目的。

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（收稿日期：2016-09-16 本文編輯：王紅雙）