知母皂苷AⅢ抑制人腦膠質瘤增殖生長的機制研究

譚希+潘會君+吳偉達+章丹丹

[摘要]考察知母皂苷AⅢ抑制人腦膠質瘤U87MG細胞增殖的作用及機制分析。在裸鼠皮下荷瘤模型中，知母皂苷AⅢ組與模型組相比，顯著降低瘤重。知母皂苷AⅢ呈劑量依賴性抑制U87MG細胞的體外增殖；呈劑量依賴性降低βCatenin，Cyclin D1，Bcl2的蛋白表達，同時升高p21在蛋白和基因水平的表達；降低ERK磷酸化水平，抑制βCatenin的核轉移，同時提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平。聯用JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580后可逆轉知母皂苷AⅢ處理而提高的p21和降低的βCatenin的蛋白表達。知母皂苷AⅢ部分通過干預MAPK及Wnt/βCatenin信號通路而抑制腦膠質瘤U87MG的增殖。

[關鍵詞]知母皂苷AⅢ；人腦膠質瘤U87MG；細胞增殖；MAPK信號通路；Wnt/βCatenin信號通路

[Abstract]To explore the inhibitory effect of timosaponin AⅢ on the proliferation of human glioblastoma cell line U87MG and investigate its related mechanism As compared with the model group， the tumor weight was significantly reduced in timosaponin AⅢtreated group Timosaponin AⅢinhibited the proliferation of U87MG cell line in a dosedependent manner It upregulated the gene and protein expression levels of p21， meanwhile inhibited the protein expression levels of βCatenin， Cyclin D1 and Bcl2 It also inhibited the translocation of βCatenin into nucleus， suppressed the phosphorylation expression of ERK， but increased the phosphorylation expression of p38 and JNK Combined use of JNK inhibitor SP600125 and p38 inhibitor SB203580 could decrease p21 and increase βCatenin protein expressions Timosaponin AⅢ inhibited the proliferation of human glioblastoma cell line U87MG partly by intervening MAPK and Wnt/βCatenin signal pathways

[Key words]timosaponin AⅢ； human glioblastoma cell U87MG； cell proliferation； MAPK signal pathway； Wnt/βCatenin signal pathway

中藥知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge的干燥根莖，具有滋陰潤燥、清熱瀉火等功效。其性寒，味苦，歸肺、胃、腎經，臨床用于外感熱病、骨蒸潮熱、肺熱燥咳、高熱煩渴等癥狀[1]。其主要藥理活性成分知母皂苷在知母根莖中的質量分數約為6% [2]。國內外研究人員發現知母皂苷AⅢ能抑制ADP誘導的血小板聚集、誘導腫瘤細胞自噬等[34]，近年來對于知母皂苷AⅢ抗腫瘤活性的研究日益深入[57]，有希望將其開發成一種新的抗癌類藥物。

腦膠質瘤（腦膠質細胞瘤）約占顱內腫瘤的70%。惡性腦膠質瘤是34歲以下腫瘤患者的第二位死亡原因，患者平均存活的中位時間是14個月。腦膠質瘤多呈侵襲性生長，總體療效不佳，是神經外科治療中最棘手的難治性腫瘤之一[810]。目前尚未有知母皂苷AⅢ抑制腦膠質瘤增殖生長的相關報道。該文考察知母皂苷AⅢ體內外抑制腦膠質瘤增殖生長的作用并基于MAPK信號通路和Wnt/βCatenin信號通路考察其機制。

1材料

11藥物與試劑知母皂苷AⅢ、淫羊藿苷Ⅱ、紅景天苷、原薯蕷皂苷元均購自上海同田生物技術股份有限公司；人腦惡性膠質瘤細胞株U87MG購自美國ATCC公司；DMEM干粉培養基、胎牛血清購自Gibco公司；二甲基亞砜、噻唑藍購自西格瑪奧德里奇（SigmaAldrich）公司；cDNA逆轉錄試劑盒、Trizol試劑購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司；RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑PhosSTOP均購自美國Roche公司；引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。Marker預染蛋白購自Progema公司；NC膜購自英國沃特曼Whatman公司；一抗βactin，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK，βCatenin購自美國細胞生物技術（Cell Signaling Technology）公司；p21、Cyclin D1抗體、二抗山羊抗鼠、二抗山羊抗兔均購自美國abCAM公司。ECL化學發光試劑盒購自美國通用公司生命技術科學部門（GE）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA蛋白強裂解液、Bcl2抗體、HDAC1抗體、細胞核蛋白細胞漿蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

12儀器生物安全柜（Delta series，Labconco，美國）；CO2培養箱（HEPA CLASS100，Thermo，美國）；細胞計數儀（XDS500C，上海蔡康光學儀器有限公司）；倒置顯微鏡（IX 71，Olympus，日本）；QB9006 恒溫微孔板快速振蕩器（海門市其林貝爾儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（7500 Fast System，Applied Biosystems公司，美國）；超聲波細胞粉碎機（JY922D，寧波新芝生物股份有限公司）；低溫高速離心機（Eppendorf Centrifuge 5810R，德國）；電泳儀（PowerPacTMHC，BIORAD公司，美國）；脫色搖床（TS8，Kylinbell Lab Instruments，中國）；凝膠成像系統（Tanon NIM2045，上海天能公司）；Spectra MAX190酶標儀（MD公司，美國）。

2方法

21細胞培養U87MG細胞培養于添加了10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃恒溫、5%CO2培養箱中飽和濕度的條件下培養。穩定傳2～3代后，選擇處于對數生長期細胞用于后續實驗。

22建立裸鼠皮下移植瘤模型在裸鼠左上肢腋下緩慢推注注射02 mL U87MG細胞混懸液，含2×106個細胞。定期觀測裸鼠成瘤的時間和瘤體積大小。腫瘤的體積用游標卡尺測量腫瘤的最長徑（a）及最短徑（b），并根據公式V= ab2/2進行計算。成瘤后，給予中藥單體1 mg·kg-1腹腔注射14 d，取瘤稱重，免疫組化檢測Ki67。

23MTT法考察知母皂苷AⅢ對U87MG腦膠質瘤細胞增殖能力的影響U87MG細胞懸液調節成密度為5×104個/mL，每孔接種100 μL于96孔板中，在CO2培養箱中過夜。為考察知母皂苷AⅢ對U87MG細胞增殖能力的影響，預試驗中設置24，48，72 h時間點，數據差異不大（未顯示），最終選擇24 h為MTT檢測時間。知母皂苷AⅢ于125，25，5，10 μmol·L-1劑量處理U87細胞，孵育24 h后，每孔加入 5 g·L-1 MTT（1×PBS為溶劑）溶液20 μL，繼續避光培養 4 h，棄上清，每孔加入 150 μL DMSO，37 ℃搖床振搖5～10 min至其充分溶解，于酶標儀測得在490 nm波長下的吸光度A，計算用知母皂苷AⅢ不同濃度處理的各組細胞的細胞活性。細胞活性率=（A給藥組-A空白對照組） / （A對照組-A空白對照組） ×100%。每組獨立實驗重復3次。

24QRTPCR考察知母皂苷A Ⅲ對細胞凋亡信號通路中p21 mRNA表達的影響為考察知母皂苷AⅢ對細胞周期的影響，檢測其對細胞周期阻滯蛋白p21的表達的影響，文獻報道知母皂苷AⅢ誘導白血病細胞凋亡時間為4 h[11]，預實驗中比較了4，6，24 h知母皂苷AⅢ誘導p21基因和蛋白表達變化（數據未顯示），最終確定4 h檢測p21基因表達變化，6 h檢測蛋白表達變化。U87MG細胞貼壁過夜培養后，更換為新鮮的無血清DMEM培養液，給藥處理組加入知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）繼續培養4 h，每組加1 mL Trizol按照Trizol說明書提取步驟收集各組細胞的總RNA，讀取和計算各組RNA濃度，加DEPC水將全部樣品的RNA調整至同一質量濃度500 mg·L-1。A260/A280在18～20的樣品進行逆轉錄。按照HighCapacity逆轉錄試劑盒說明書，20 μL逆轉錄體系的反應條件為：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，產物置于4 ℃備用。按照RealMasterMix（SYBR Green） 說明書，以20 μL反應體系合成模板cDNA，進行定量反轉錄聚合酶鏈式反應（QRTPCR）。引物序列如下：p21 Forward 5′TGAGCCGCGACTGTGATG3′；Reverse 5′GTCTCGGTGACAAAGTCGAAGTT3′； βactin Forward 5′CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC3′；Reverse 5′CGGACTCGTCATACTCCTGCT3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。反應條件為： 95 ℃ 10 min，50 ℃ 2 min，95 ℃預變性15 s，53 ℃ 1 min，擴增40個循環。每組樣品均做3個復孔。知母皂苷AⅢ處理組的相對含量用2ΔΔCt計算得出。每組獨立實驗重復3次。

25Western blot考察知母皂苷AⅢ及抑制劑聯用對信號通路中關鍵蛋白表達含量的影響為考察知母皂苷AⅢ對MAPK信號通路的影響，而蛋白磷酸化水平隨時間變化而變化，最終確定知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1） 處理30 min后，收集蛋白檢測MAPK主要蛋白的磷酸化水平。細胞分為空白對照組、抑制劑聯用組為抑制劑聯用預處理1 h后加入知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）、抑制劑聯用單獨處理組、知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）單用組處理6 h，冰鎮1×PBS清洗，加入磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和RIPA強細胞裂解液后收集細胞，超聲細胞粉碎機超聲破碎（3次，3 s/次），離心機在4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min后取上清。根據細胞核蛋白細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書，對細胞核蛋白和漿蛋白進行分離。各組蛋白均用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。電泳前將每組15 μg的蛋白以4∶1的比例加入5×loading buffer，金屬浴95 ℃ 2 min后即用10%或12%的SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕轉法將蛋白轉到NC膜上后，用5%脫脂牛奶或5%BSA溶液封閉1 h，分別用一抗βactin，βCatenin，Cyclin D1，p21，Bcl2，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK，4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜5 min，6次后加入相應二抗（1∶1萬）孵育，TBST洗膜5 min，6次后，ECL顯影液顯影。每組獨立實驗重復3次。

26統計分析本實驗所有計量資料均以±s表示，兩樣本組間比較采用t檢驗，P<005為差異具有統計學意義。

3結果

31知母皂苷AⅢ對裸鼠皮下荷瘤模型的影響與模型組比較，知母皂苷AⅢ處理組的瘤重呈顯著性降低（P<005）。而淫羊藿苷Ⅱ、紅景天苷、原薯蕷皂苷元處理組的瘤重有一定的下降趨勢，但無顯著性差異（圖1）。Ki67的表達與腫瘤細胞增殖密切相關，臨床上Ki67作為評價惡性腫瘤細胞生長的重要指標。與模型組比較，知母皂苷AⅢ處理組的Ki67陽性細胞數顯著減少（P<005）。其余組與模型組比較，無顯著性差異（圖1）。

32知母皂苷AⅢ對U87MG細胞增殖能力的影響不同劑量的知母皂苷AⅢ（125～10 μmol·L-1）和人腦膠質瘤細胞共孵育24 h，知母皂苷AⅢ在25～10 μmol·L-1呈劑量依賴性抑制人腦膠質瘤細胞U87MG的細胞增殖（P<005）（圖2）。

33知母皂苷AⅢ對U87MG細胞中 p21 mRNA的影響經知母皂苷AⅢ處理4 h后，p21基因水平的表達呈劑量依賴性提高 （P<001）（圖3）。

34Western blot法檢測知母皂苷AⅢ對U87MG細胞中βCatenin，Cyclin D1，p21，Bcl2，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK蛋白水平的影響經知母皂苷AⅢ處理6 h 后，p21的蛋白表達上調（P<001），與其基因水平的變化一致。而βCatenin，Bcl2，Cyclin D1經干預后下調（P<001）（圖4）。經知母皂苷AⅢ處理30 min后，ERK蛋白磷酸化水平顯著降低（P<001），而p38和JNK蛋白的磷酸化水平顯著升高（P<001）（圖5）。

35Western blot法檢測聯用SP600125和SB203580對知母皂苷AⅢ干預p21和βCatenin蛋白水平的影響細胞分為空白對照組、知母皂苷AⅢ處理組（5，10 μmol·L-1）、JNK抑制劑SP600125（2 μmol·L-1）和p38抑制劑SB203580（20 μmol·L-1） 聯用組、抑制劑聯用組和知母皂苷AⅢ共同處理組。抑制劑聯用組，與空白對照組相比，不影響p21和βCatenin在U87中的蛋白表達；抑制劑聯用預處理細胞1 h 后，知母皂苷AⅢ繼續處理6 h，抑

與對照組比較1）P<005，2）P<001；與抑制劑聯用組比較3）P<005，4）P<001（圖2～7同）。

制劑聯用和AⅢ 10 μmol·L-1共同處理組與AⅢ 10 μmol·L-1劑量單獨使用組相比，p21的蛋白表達顯著下調，βCatenin顯著上調，逆轉了AⅢ處理后提高p21和降低βCatenin的蛋白變化趨勢（圖6）。

36Western blot法檢測細胞核和細胞質中對知母皂苷AⅢ干預βCatenin蛋白水平的影響經知母皂苷AⅢ處理6 h后，知母皂苷AⅢ處理組與空白對照組共同進行細胞核和細胞質蛋白的分離，檢測核質內βCatenin蛋白的表達變化。U87MG細胞經AⅢ干預后，βCatenin的核蛋白表達顯著降低（圖7）。在AⅢ 10 μmolL-1劑量處理組中，該組的細胞核內βCatenin的蛋白表達相比于空白對照組有顯著下降（P<005）。而細胞質中的βCatenin蛋白表達與空白對照組相比無顯著變化。

4結果與討論

Wnt/βCatenin信號通路與腫瘤發生等多種疾病的病理過程相關，在多個細胞過程（分化、遷移、極性和增殖）中發揮重要作用。在膠質瘤組織中，WNT1表達比正常腦組織顯著提高，并與Cyclin D1的表達顯著相關。Kailiang等基于UCSC癌癥基因數據庫分析發現βCatenin和Cyclin D1在人腦膠質瘤細胞中呈高表達狀態[12]。βCatenin作為核轉運受體，通過與黏附分子相互作用，獲得協調核功能和細胞黏附的屬性[13]。熊果酸可通過降低βCatenin的核轉移干預Wnt/βCatenin信號通路而抑制骨肉瘤的生長[14]。在本研究中，經知母皂苷AⅢ處理后，

U87MG細胞中βCatenin，Cyclin D1和Bcl2的蛋白表達水平均呈劑量依賴性降低，且AⅢ 10 μmol·L-1能顯著降低βCatenin的核轉移。

周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑p21（也稱為p21WAF1/CIP1蛋白）是響應于各種刺激促進細胞周期阻滯的一個因素，在轉錄調控調節、抑制細胞凋亡、DNA修復中發揮作用[15]。p21由p53依賴性和p53非依賴性的機制來誘導。在p53非依賴性機制中，在有些情況下，p21具有促進細胞凋亡的作用[16]。結果顯示，知母皂苷AⅢ處理后，可于體外顯著提高U87細胞中p21在基因和蛋白水平的表達。

絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是一種廣泛存在于真核生物胞漿中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由細胞外信號引發細胞核內反應的一條經典通路，影響著細胞形成、分化、生長、增殖及凋亡等多個生命過程。研究表明有4條信號通路存在于MAPK家族中：ERK（extracellular signalregulated kinase）即細胞外信號調節激酶、JNK （cJun Nterminal kinase）即cJun N端激酶、MAPKp38和ERK5/BMK1通路。在哺乳動物中，MKK4（MAP2K4）和MKK7（MAP2K7）磷酸化并激活JNK，而MKK3（MAP2K3），MKK4，MKK6和（MAP2K6）激活p38[17]。ERK是腫瘤細胞成癮性基因，ERK信號通路與細胞增殖生長密切相關[18]。JNK和p38調節細胞存活（如Bcl2和Bax），細胞周期（如P53和Cyclin D1）和細胞增殖（如JUN和MYC）眾多基因的表達[17]。JNK通路參與知母皂苷AⅢ對人黑色素瘤A375細胞[19]和白血病HL60[11]誘導凋亡作用。本實驗結果表明，知母皂苷AⅢ呈劑量依賴性降低U87MG細胞中ERK蛋白的磷酸化，同時呈劑量依賴性提高p38和JNK的磷酸化水平。聯用JNK抑制劑SP600125（2 μmol·L-1）和p38抑制劑SB203580（20 μmol·L-1）可逆轉知母皂苷AⅢ在10 μmol·L-1劑量對p21蛋白的提升作用和對βCatenin的抑制作用，而抑制劑聯用組對p21和βCatenin的蛋白表達的影響，與對照組相比無統計學差異，結果提示JNK和p38信號通路參與知母皂苷AⅢ抑制U87MG細胞增殖的進程。

綜上所述，知母皂苷AⅢ部分通過MAPK和Wnt/βCatenin信號通路，提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平，抑制ERK蛋白的磷酸化水平，抑制βCatenin的核轉移，提高p21和抑制Bcl2，Cyclin D1等抗凋亡蛋白的表達，從而抑制人腦膠質瘤細胞U87MG的體外增殖和體內生長。

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