氣相色譜—質譜法測定動物肝臟中β—受體激動劑殘留

姚德祥+杜作東+黎小鵬

摘要 研究了動物肝臟中3種β-受體激動劑（包括鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺）殘留量的氣相色譜-質譜測定方法。樣品經乙酸銨、乙酸乙酯∶異丙醇（6∶4）提取，PCX陽離子交換柱凈化，再經BSTFA衍生，HP-5MS毛細管柱分離，基質匹配內標法定量。結果表明：3種β-受體激動劑在1.0～20.0 μg/L濃度范圍內均有良好的線性關系，相關系數不低于0.998，在17.5 min內獲得良好的分離，3種β-受體激動劑加標回收率為85.4%～106.7%，相對標準偏差在4.9%～10.5%之間（n=6） 。

關鍵詞 氣相色譜-質譜法；動物肝臟；鹽酸克倫特羅；沙丁胺醇；萊克多巴胺

中圖分類號 X839.2；TS207.5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）23-0244-02

Abstract A Gas Chromatography-Mass Spectrometry method was developed for rapid determination of 3 β-agonists residue（including clenbuterol，salbutamol，ractopamine） in pig liver.The samples were extracted with ammonium acetate，ethyl acetate∶isopropanol（6∶4） and cleaned up by PXC column.The targer compounds were derivatized with BSTFA and detected by GC-MS.A matrix matched internal standard was used for quantitative analysis.The results showed that three β-agonists well separated within 17.5 min.The calibration curves were in good linearity between the peak area and the concentration of 1.0～20.0 μg/L for 3 β-agonists with correlation coefficients not less than 0.998.The spiked recoveries ranged from 85.4% to 106.7% with RSD′s in the range of 4.9%-10.5% （n=6）.

Key words GC-MS；animal liver；clenbuterol；salbutamol；ractopamine

β-受體激動劑又叫瘦肉精，是一類結構功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇類衍生物[1]，是一種擬交感神經作用藥，具有松弛平滑肌、支氣管擴張等作用，常用來治療支氣管哮喘等疾病[2]。其能夠用來改善動物養分的代謝途徑，促進動物肌肉的合成，抑制脂肪合成的積累，即具有營養“再分配效應”[3]，被不法商家添加于動物飼料中，用以減少動物脂肪含量，提高畜禽產品瘦肉率。但是食用含有瘦肉精的畜禽會嚴重危害人類健康，我國已經明確將其列入禁用藥品目錄。

目前，有關β-受體激動劑的分析檢測方法有液相色譜[4]、（氣相、液相）色譜-質譜法[5-6]、免疫吸附法[7]等。本文利用固相萃取/氣相色譜-質譜法對動物肝臟中鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種β-受體激動劑進行測定，該方法前處理簡單，回收率和精密度均較好。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

IKA T18勻漿機（德國IKA公司），固相萃取裝置，Ohaus先行者百分之一天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司），Poxwar漩渦混合器（蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司），海科氮吹儀（青島海科儀器有限公司），固相萃取裝置，Agilent 7890A-5977型氣相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫公司）。氯化鈉、分析純異丙醇、乙酸乙酯、高氯酸、氫氧化鈉、氨水、乙酸銨，以上均為分析純，均由廣州化學試劑廠生產；色譜純甲苯由德國Merck公司生產；衍生劑BSTFA由美國Supelco公司生產；60 mg 3 mL PCX固相萃取小柱由美國Waters公司生產。

鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種β-受體激動劑標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer，用甲醇將其分別配制成1 000 mg/L標準溶液，使用前用甲醇稀釋成所需濃度的混標工作液。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的提取與凈化。將肝臟（豬肝、牛肝）用絞肉機絞碎后，稱取5.0 g（精確到0.01 g）到50 mL塑料離心管中，加入50 μL內標液，10.0 mL（pH=5.2）的乙酸銨溶液，用高氯酸溶液調節pH值至1.0±0.2，高速渦旋3 min后，離心（8 000 r/min）3 min，收集上清液到50 mL塑料離心管中，往固體沉淀加入5 mL（pH=5.2）的乙酸銨溶液高速渦旋3 min，再次離心，合并2次乙酸銨提取液。用10 mol/L氫氧化鈉調節pH值至10.0±0.2，離心（8 000 r/min）3 min。

將上清液轉移到裝有8 g氯化鈉的100 mL塑料離心管中，加入15 mL乙酸乙酯-異丙醇（6∶4）高速渦旋3 min，離心（8 000 r/min）3 min。提取上層有機層至15 mL玻璃試管中，氮吹。同時再加入10 mL乙酸乙酯-異丙醇（6∶4）進行第2次萃取，離心后合并所有有機提取液，繼續氮吹至近干。加入3 mL（pH=5.2）的乙酸銨溶液，漩渦振蕩后待凈化。

PCX小柱依次用5.0 mL甲醇、2.0 mL水和4.0 mL 30 mmol鹽酸溶液預淋洗活化，然后倒入上述待凈化液，依次用4.0 mL水、4.0 mL甲醇洗脫，吹干柱中殘液，去掉洗脫液，最后加入5.0 mL氨化甲醇洗脫，用10 mL帶旋塞的玻璃試管收集濾出液。將收集濾出液的試管置于氮吹儀，于55 ℃氮吹至全干，不蓋蓋子在80 ℃烘箱中進一步鼓風烘干20 min，待試管恢復至室溫，分別加入100 μL甲苯和100 μL BSTFA蓋上蓋子漩渦混合2 min，于80 ℃烘箱中衍生反應1 h，待試管恢復至室溫，轉移至帶有內插管的進樣瓶中，供氣相色譜-質譜聯用儀測定。

1.2.2 色譜條件。色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30.0 m×0.250 mm×0.25 μm）；進樣體積：1 μL；進樣方式：不分流進樣；進樣口溫度：220 ℃；載氣及流速：氮氣0.8 mL/min；程序柱溫：70 ℃保持0.6 min，以25 ℃/min升溫至200 ℃，保持4 min，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min；GC/MS傳輸線溫度：280 ℃。檢測器及溫度：EI離子源220 ℃，四級桿160 ℃；定量方法：內標法。

2 結果與分析

2.1 3種β-受體激動劑的標準色譜圖

試驗選用HP-5MS柱作為分析用色譜柱，通過綜合考慮3種待測β-受體激動劑的理化性質，對氣相色譜-質譜聯用儀的升溫程序進行優化，得到1.2.2中所述色譜條件，用該條件測得3種β-受體激動劑標準色譜圖（圖1），結果表明，3種待測β-受體激動劑在17.5 min內得到良好分離，能滿足動物肝臟中β-受體激動劑殘留分析要求。

2.2 標準曲線、線性范圍及檢出限

為消除基質效應對測定結果的影響，試驗采用空白樣品添加標準工作液的方法制備標準工作曲線，鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇添加濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/kg，萊克多巴胺添加濃度分別為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/kg。繪制出標準曲線，回歸方程及相關系數見表1。3種待測β-受體激動劑均呈良好線性關系，r2均大于0.998。

2.3 回收率和精密度

按照1.2的提取凈化方法和色譜條件，采用標準加入法，在空白肝臟（豬肝、牛肝）樣品中添加3.0 μg/kg（萊克多巴胺6.0 μg/kg）和8.0 μg/kg（萊克多巴胺16.0 μg/kg）2種水平的3種β-受體激動劑混合標樣進行加標回收試驗，并進行6個樣品的重復測定，3種β-受體激動劑的平均加標回收率在85.4%～106.7%之間，其相對標準偏差在4.9%～10.5%之間。方法回收率和精密度均能滿足試驗要求。

3 結論與討論

本文建立了氣相色譜-質譜法測定動物肝臟中多種β-受體激動劑殘留量的分析方法。該方法簡單、回收率高，采用PCX小柱可以提高柱層析效率，方法準確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析檢測的要求，適合于豬肝、牛肝中多種β-受體激動劑殘留的測定。

4 參考文獻

[1] 梁曉聰，程國霞，朱參勝.GC/MS法同時測定動物組織中4種β-興奮劑殘留量[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18（2）：199-200.

[2] 聶國榮.β-受體激動劑正副作用及檢測方法[J].中國動物檢疫，2001，18（6）：43-44.

[3] 丁煥中，陳杖榴，楊志凌.營養重分配劑萊克多巴胺的藥理作用和應用[J].獸藥與飼料添加劑，2002，7（1）：18-20.

[4] 尚紅霞，盧業玉，黃寶華，等.固相萃取-高效液相色譜法同時測定克倫特羅和沙丁胺醇[J].分析科學學報，2003，19（2）：145-147.

[5] 孔瑩，邱月明，李鵬，等.固相萃取/氣相色譜-質譜同時測定豬肉中4種β-激動劑類藥物殘留量[J].分析測試學報，2006，25（2）：63-66.

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[7] 萬宇平，劉寧，陶光燦，等.組織中β-興奮劑類藥物多殘留酶聯免疫檢測方法的建立[J].河南農業科學，2013，42（2）：132-135.