HPLC法測(cè)定復(fù)方阿膠膏中4種氨基酸的含量

張潔　白娟　朱倩云　李成網(wǎng)

[摘要]目的建立復(fù)方阿膠膏中4種的含量測(cè)定方法。方法采用HPLC法，Shimpack ODS C18柱（4.6mm×250mm，5um），以乙腈-0.1mol/L乙酸鈉溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5，7：93）為流動(dòng)相A，以乙腈-水（4：1）為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸分別在12.46～124.6ug/mL、23.62～236.2ug/mL、8.47～84.7ug/mL、19.14～191.4ug/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999，n=6），平均加樣回收率分別為97.91%、97.77%、97.67%、97.65%，RSD分別為1.70%、1.18%、1.31%、1.29%（n=9）。結(jié)論本法準(zhǔn)確可靠，可用于復(fù)方阿膠膏的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜；復(fù)方阿膠膏；-羥脯氨酸；甘氨酸；丙氨酸；L-脯氨酸

復(fù)方阿膠膏為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由阿膠、黃芪、枸杞子、核桃仁等八味中藥組成，以養(yǎng)血益氣為主，滋補(bǔ)肝腎、健胃消食、溫肺潤(rùn)腸為輔。主用于氣血兩虛證所致的諸多疾病。其中阿膠為君藥，阿膠中的主要有效成分為蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸。該方原采用凱氏定氮法測(cè)總氮含量為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但由于該制劑為復(fù)方制劑，干擾較大，該方法測(cè)得的結(jié)果誤差較大，不夠準(zhǔn)確。因此在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，于2015年10月～2016年1月期間，采用HPLC法以甘氨酸、丙氨酸、L-羥脯氨酸和L-脯氨酸四種阿膠中含量較高的氨基酸為定量指標(biāo)，對(duì)復(fù)方阿膠膏進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

1.儀器與試藥

LC-20ATvp島津液相色譜儀（日本島津公司）；SPD-20Avp檢測(cè)器（日本島津公司）；梅特勒AG285電子分析天平（瑞士）；梅特勒xp56型百萬分之一電子天平（瑞士）；JK-300型超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）。復(fù)方阿膠膏（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，批號(hào)：20150306、20150313、20150320），缺阿膠陰性制劑為自制。L一羥脯氨酸對(duì)照品（批號(hào)110766-200518）、甘氨酸對(duì)照品（批號(hào)110805-200306）、丙氨酸對(duì)照品（批號(hào)110780-200506）、L-脯氨酸對(duì)照品復(fù)（批號(hào)111626-200906）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2.方法與結(jié)果

2.1色譜條件嘲

色譜柱：Shimpack ODS C18柱（4.6mm×250mm，5um）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流動(dòng)相：以乙腈-0.1mol/L乙酸鈉溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5，7：93）為流動(dòng)相A，以乙腈-水（4：1）為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10uL；柱溫：43℃。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甘氨酸、丙氨酸、L-羥脯氨酸、L-脯氨酸對(duì)照品適量，加0.1mol/L的HCl溶液制成每lmL含甘氨酸110ug、丙氨酸40ug、L-羥脯氨酸50ug、L-脯氨酸90ug的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備

取樣品1g，精密稱定，置25mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液20mL超聲使溶解，加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻。精密量取5mL，加鹽酸5mL，150℃水解1h，放冷，移至蒸發(fā)皿中，用水10mL分次洗滌容器，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1mol/L鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。

2.4陰性供試品溶液的制備

取缺阿膠的陰性制劑1g，同法制成陰性供試品溶液。

2.5柱前衍生化

精密量取上述溶液各5mL，分別置25mL量瓶中，分別加0.1mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5mL和lmol/L三乙胺的乙腈溶液2.5mL，搖勻，室溫放置1h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。取10mL，加正己烷10mL振搖萃取，放置10min，分取下層液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取衍生化后的混合氨基酸對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各10uL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果理論塔板數(shù)按甘氨酸計(jì)N=8725，分離度R=2.7，拖尾因子t=1.03。陰性供試品溶液無干擾。色譜圖見圖1。

2.7線性考察

精密稱取甘氨酸對(duì)照品5.906mg、丙氨酸對(duì)照品2.118mg、L-羥脯氨酸對(duì)照品3.115mg、L-脯氨酸對(duì)照品4.784mg，置25mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含甘氨酸236.2ug/mL、丙氨酸84.7ug/mL、L-羥脯氨酸124.6ug/mL、L-脯氨酸191.4ug/mL的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL置10mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液各10uL，依次注入液相色譜儀中，依法測(cè)定，記錄峰面積積分值，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程分別為：甘氨酸A=20963C-39112（R=0.9999，n=6）；丙氨酸A=15000C-31897（R=0.9999，n=6）；L-羥脯氨酸A=12997C-14346（R=0.9999，n=6）；L-脯氨酸A=12997C-14346（R=0.9999，n=6）。結(jié)果：甘氨酸在23.62～236.2ug/mL范圍內(nèi)；丙氨酸在8.47～84.7ug/mL范圍內(nèi)；L-羥脯氨酸在12.46～124.6ug/mL范圍內(nèi)；L-脯氨酸在19.14～191.4ug/mL范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.8精密度試驗(yàn)

取供試品溶液，衍生化處理后，精密吸取同一供試品溶液10uL，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，記錄4種氨基酸的峰面積，計(jì)算。結(jié)果：L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的RSD分別為0.46%、0.46%、0.43%、1.03%，說明儀器精密度良好。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，衍生化處理后，置室溫下放置，分別于配制后0、2、4、6、8、lOh，精密吸取10uL依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算。結(jié)果：L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的RSD分別為0.52%、0.69%、0.43%、0.96%，說明供試品溶液中的4種氨基酸在室溫下10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批樣品，平行6份，分別依法制備供試品溶液，衍生化處理，分別精密吸取10uL依法測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果：L-羥脯氨酸平均含量為6.74mg，g，RSD=1.34%、甘氨酸平均含量為14.37mg/g，RSD=0.80%、丙氨酸平均含量為5.22Mg/g，RSD=1.55%、L-脯氨酸平均含量為11.23mg/g，RSD=1.12%。說明本方法重現(xiàn)性良好。

2.11日間精密度試驗(yàn)

取同一批樣品共6份，分別由不同操作人員在不同時(shí)間依法制備供試品溶液，衍生化處理，依法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果：L-羥脯氨酸日間平均含量為6.76mg/g，日間RSD=1.18%、甘氨酸日間平均含量為14.30mg/g，日間RSD=0.89%、丙氨酸日間平均含量為5.14mg，g，日間RSD=1.06%、L-脯氨酸日間平均含量為11.25mg/g，日間RSD=0.40%。說明本方法日間精密度良好。

2.12加樣回收率試驗(yàn)

取重現(xiàn)性樣品約0.5g，平行9份精密稱定，分別置25mL量瓶中，精密加入混合對(duì)照品適量，依法制備、測(cè)定、計(jì)算回收率，見表2～5。

試驗(yàn)結(jié)果表明：加樣回收率良好，供試品溶液的制備過程不影響各氨基酸的含量。

2.13樣品測(cè)定

取中試樣品，依法測(cè)定各氨基酸含量，計(jì)算。結(jié)果：L-羥脯氨酸的含量分別為6.78、6.70、6.62mg/g；甘氨酸的含量分別為14.78、14.49、14.37mg/g；丙氨酸的含量分別為4.75、4.83、4.92mg，g；L-脯氨酸的含量分別為11.19、11.12、11.30mg/g。

3.討論

2015年版中國(guó)藥典規(guī)定阿膠藥材按干燥品計(jì)算，含L-羥脯氨酸不得少于8.0%，甘氨酸不得少于18.0%，丙氨酸不得少于7.0%，L-脯氨酸不得少于10.0%。故制劑中各氨基酸的最低理論含量分別為L(zhǎng)-羥脯氨酸8.0mg/g、甘氨酸18.0mg/g、丙氨酸7.0mg/g、L-脯氨酸10.0mg/g。根據(jù)3批中試樣品的測(cè)定結(jié)果，考慮到制劑過程中的損失，將本制劑中各氨基酸的含量限度暫定為：本品每1g中含L-羥脯氨酸不得少于5.0mg/g，甘氨酸不得少于10.0mg/g，丙氨酸不得少于3.0mg/g，L-脯氨酸不得少于8.0mg/g。

供試品溶液制備過程中需在150℃水解1h，本文采用的是頂空進(jìn)樣瓶密封后置烘箱中加熱水解，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用安剖瓶密封后水解。此外，筆者還考察了柱前衍生化后正己烷的萃取次數(shù)對(duì)測(cè)定影響，發(fā)現(xiàn)萃取1次，2次，3次對(duì)結(jié)果沒有影響。另有文獻(xiàn)報(bào)道，柱前衍生化法可同時(shí)測(cè)定阿膠中17種氨基酸的含量，本文也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)除了甘氨酸、丙氨酸、L-羥脯氨酸和L-脯氨酸以外，其他氨基酸含量均較低，且相互分離度和峰型也不佳?？紤]到不同產(chǎn)地和批次的藥材差異，以及文獻(xiàn)報(bào)道均為阿膠單昧藥材的含量測(cè)定，而本文討論的是復(fù)方制劑的含量測(cè)定，處方中其他藥味的化學(xué)成分，水解后都會(huì)對(duì)氨基酸的測(cè)定造成干擾，故未收載其他氨基酸的含量測(cè)定。

本文使用的流動(dòng)相參考了2015版中國(guó)藥典一部阿膠項(xiàng)下的流動(dòng)相，但按照藥典規(guī)定的梯度洗脫步驟，丙氨酸和L-脯氨酸的分離度達(dá)不到R>1.5的要求，經(jīng)不斷調(diào)整發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的比例，酸度和柱溫都對(duì)氨基酸的峰型、保留時(shí)間和分離度均有顯著影響。尤其是柱溫，低于40℃或者高于45℃，都會(huì)減小丙氨酸和L-羥脯氨酸的分離度，只有在43℃時(shí)，分離度達(dá)到最大。因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制柱溫和環(huán)境溫度，以保證分析效果最佳。

本方法可為含阿膠的復(fù)方制劑建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。但由于實(shí)驗(yàn)條件有限，還有很多工作有待進(jìn)一步完善，未來還計(jì)劃使用氨基酸專用色譜柱、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、氨基酸分析儀等，對(duì)復(fù)方阿膠膏中的多種氨基酸進(jìn)行分析及定量。