人骨髓間充質干細胞對腦膠質瘤細胞增殖的影響

朱汝森++陳興貴++蘭柳波+李錦宏++楊帆

[摘要]目的 檢測人骨髓間充質干細胞（hMSCs）對腦膠質瘤細胞生長增殖的影響，評估應用hMSCs治療人腦膠質瘤的生物安全性。方法 獲取hMSC的條件培養基（hMSCs-CM）；實驗組人腦膠質瘤細胞U251培養于hMSCs-CM，對照組U251細胞培養于hMSCs-CM的基礎培養基；以MTT實驗檢測細胞增殖能力的變化。結果 MTT結果顯示，與對照組比較培養于hMSCs-CM的實驗組U251細胞的增殖能力明顯提高，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 hMSCs-CM可促進腦膠質瘤細胞的增殖，對hMSCs應用于腦膠質瘤治療的生物安全性問題需引起關注。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；腦膠質瘤；基因治療；細胞增殖

[中圖分類號] R318 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（b）-0013-03

Influence of human bone marrow mesenchymal stem cells on human glioma cells proliferation

ZHU Ru-sen1 CHEN Xin-gui2 LAN Liu-bo3 LI Jin-hong1 YANG Fan1

1.Department of Neurosurgery，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524001，China；2.Cancer Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524001，China；3.Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524023，China

[Abstract]Objective To detect the influence of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells （hMSCs） on glioma cell proliferation and evaluate the biological safety of treating glioma with hMSCs.Methods The hMSCs-conditioned medium （hMSCs-CM） was obtained；human glioma cells U251 in the experiment group were cultured in hMSCs-CM，and U251 in the control group was cultured in the basal medium of hMSCs-CM；changes of cell proliferation were detected by MTT assay.Results The results of MTT assay showed that，compared with the control group，the proliferation of U251 of the experient group that cultured in hMSCs-CM increased significantly，and the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion hMSCs-CM can promote the proliferation of U251，and it is need to pay attention to the biological safety of treating glioma with hMSCs.

[Key words]Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells；Glioma；Gene therapy；Cells proliferation

骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，MSCs）由于具有在中樞神經系統中獨特的遷移性及對腦膠質瘤細胞的定向遷移能力，在很多研究中發現可以有效地將治療基因轉送到腦膠質瘤中，以MSCs作為基因載體對腦膠質瘤進行靶向基因治療的研究近年來成為熱點[1-5]。目前更多的研究所關注的是MSCs作為基因載體這種應用的有效性，而關于MSCs自身對腦膠質瘤細胞的作用未被重視。對于是否存在MSCs自身可促進腦膠質瘤細胞生長增殖的風險并未明確，而這關系到應用MSCs治療腦膠質瘤的生物安全性問題。本實驗通過檢測人骨髓間充質干細胞（human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，hMSCs）對人腦膠質瘤細胞生長增殖的影響，評估應用hMSCs治療人腦膠質瘤的生物安全性。

1材料與方法

1.1人骨髓間充質干細胞的獲取和培養

在前期的研究中已經建立了獲取hMSCs的成熟方法[6]。抽取健康成人志愿者的骨髓組織，于Percoll細胞分離液（瑞典Pharmacia）中通過密度梯度離心獲取中間的有核細胞層，接種于培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基（美國Hyclone），置于37℃、5%CO2培養箱中培養，48 h后換液，去除未貼壁的細胞，每周更換培養液兩次，待細胞密度達70%～80%后，以0.25% 胰酶+0.02% EDTA消化傳代。取第2～10代的細胞作后續實驗。

1.2人骨髓間充質干細胞誘導分化能力的檢測

將第2～5代的hMSCs以0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，按1×105個/cm2的密度培養于含有B27/N2（美國Gibco BRL）的無血清DMEM/F12培養液，并加入20 ng/ml的EGF和bFGF（美國Sigma），置于37℃、5%CO2培養箱中培養。培養液每周更換一次，生長因子每周添加2次。培養10～15 d后，神經球樣結構可見形成。將神經球樣結構的細胞以4%的甲醛固定，通過常規免疫組化的方法檢測神經干細胞標志性蛋白nestin的表達。免疫組化實驗所使用的抗體及濃度為：兔抗人nestin，1∶500（美國Chemicon International）和山羊抗兔IgG Cy3，1∶100（美國Chemicon International）。細胞核以DAPI染色。

1.3人骨髓間充質干細胞的條件培養基（hMSCs-CM）的制備

將hMSCs以0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接種于75 cm2的培養皿，加入DMEM-F12加10%胎牛血清，培養于含5% CO2的37℃細胞培養箱，待細胞密度達70%～80%，以無血清的DMEM/F12洗滌，然后加入9 ml的DMEM/F12含0.1% BSA，培養3 d后，吸取培養液，通過離心（1000 g，5 min），并以孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，以去除細胞，獲得hMSCs-CM。將基礎培養基（DMEM/F12含0.1% BSA）作為實驗的對照培養基（control medium）。

1.4 MTT實驗檢測hMSCs-CM對人腦膠質瘤細胞U251增殖的影響

將對數期U251細胞以1×103個/孔接種于96 孔板，正常培養24 h后，吸除原培養基，以無血清的DMEM/F12洗滌后，實驗組加入200 μl hMSCs-CM，對照組加入200 μl對照培養基（control medium），每組設12個復孔。培養24 h后予換液，繼續培養至48 h后，于每孔加入5 μg/ml MTT溶液20 μl，以37℃孵育4 h后，將上清液全部棄去，每孔加入二甲亞砜（DMSO）溶液200 μl，溶解紫色結晶沉淀，振蕩10 min，用酶標儀在570 nm處測定其光密度（OD值）。實驗重復3次。

1.5統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 hMSCs的獲取和鑒定

獲得的hMSCs通過傳代培養后的呈長梭形，貼壁牢固，通過誘導分化培養，hMSCs可形成類似神經干細胞構成的神經球樣結構，組成神經球樣結構的細胞高度表達神經干細胞標志性蛋白nestin（圖1）。

2.2 hMSCs-CM對人腦膠質瘤細胞U251生長增殖的影響

獲得hMSCs條件培養基（hMSCs-CM），將hMSCs-CM的基礎培養基作為對照培養基。光鏡下觀察發現，培養于hMSCs-CM的人腦膠質瘤細胞U251與對照組比較，生長更加旺盛（圖2A）。MTT實驗結果顯示，培養于hMSCs-CM的實驗組U251細胞增殖能力較對照組明顯提高，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2B）。

3討論

腦膠質瘤是人類一種重要的腫瘤相關的致死因素，盡管通過廣泛的外科切除及放療、化療等其他的治療手段，其預后一直以來都是很差；現行的標準治療手段對腦膠質瘤治療所存在的困難是與其瘤細胞向周圍正常組織浸潤性生長的特性密切相關[7-8]。正是膠質瘤細胞這種呈浸潤性生長的特性也使得一些基因治療策略以及局部介入的治療方法亦難以很好地到達浸潤到周圍正常組織的膠質腫瘤細胞[9-11]。MSCs基于其具有的在中樞神經系統中獨特的遷移特性以及其對膠質瘤細胞良好的趨向性，可以有效地將目的治療基因輸送到膠質瘤細胞，因此也為腦膠質瘤的基因治療帶來了新的希望。

然而，在臨床應用前，對于hMSCs在為基因載體對腦膠質瘤進行基因治療的生物安全性問題必須得到徹底的認識和明確。有研究報道，當MSCs和某些腫瘤細胞共同種植時可表現出促進腫瘤生長的作用，其中包括乳腺癌[12-13]、卵巢癌[14]、黑色素瘤[15]及結腸癌[16]等。有研究指出，MSCs可整合到腫瘤間質，并通過旁分泌一些細胞因子，包括CCL5、IL-6、及SDF-1α等促進腫瘤的生長[12-14]；MSCs可作為腫瘤前體的成纖維細胞通過分化和分泌促癌因子在腫瘤的發生發展中其重要作用[16]；MSCs亦可通過其免疫抑制的特性幫助腫瘤細胞逃避宿主的免疫監控而促進腫瘤的發生和發展[15]。然而，也有研究得到了一些相反的結果，發現MSCs與腫瘤細胞共同種植可以抑制腫瘤的生長，包括結腸癌[17]、肝細胞癌[18]、黑色素瘤[19]等。似乎對于MSCs移植后對腫瘤生長的作用是因腫瘤而異的，與一系列的因素有關，包括MSCs的獲取和培養的方法、實驗的模型、移植到腫瘤中的細胞數量、在腫瘤微環境中的生長因子和炎癥性細胞因子種類等因素[20]。

在本研究中，筆者將人腦膠質瘤細胞U251于體外培養于人hMSCs的條件培養基中，發現相對于培養于對照培養基的U251細胞，前者的生長增殖更加旺盛，MTT實驗結果顯示細胞的增殖能力明顯提高，差異有統計學意義。hMSCs的條件培養基于體外可促進腦膠質瘤細胞的增殖，其作用機制有待進一步研究，也提示臨床工作者應該對hMSCs應用于腦膠質瘤治療的生物安全性問題需引起關注。

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（收稿日期：2017-02-27 本文編輯：任 念）