自噬相關蛋白在腎透明細胞癌與癌旁組織中表達狀況對比

謝清靈+徐桂+彬堯凱+何永忠

【摘要】 目的：對比自噬相關蛋白在腎透明細胞癌與癌旁組織中表達狀況。方法：選取2016年3月20日-2017年3月20日本院收治的50例實施根治性腎切除術患者為研究對象，手術過程中切取患者兩部分組織，一部分為癌變組織，一部分為癌旁組織（即正常組織），且將其制作為標本，對其進行免疫組化染色測定、組織芯片制作、IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量，并對自噬相關蛋白表達水平變化進行相關性分析。結果：從免疫組化染色評分角度分析，腫瘤組織的ATG7（1.36±0.58）、LC3（2.05±0.36）、Beclin 1（0.55±0.32）水平均低于正常組織[（2.63±0.78）、（3.48±0.45）、（2.47±0.69）]，而ULK1（3.69±0.45）、P62（3.54±0.37）、P-mTOR（2.99±0.85）均高于正常組織[（2.69±0.35）、（2.31±0.45）、（2.05±0.36）]，差異均有統計學意義（P<0.05），腫瘤組織和正常組織的ATG5值分別為（2.67±0.54）、（2.45±0.66），差異無統計學意義（P>0.05）；從IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結果角度分析，腫瘤組織的ATG7（0.029±0.010）、LC3（0.021±0.010）、Beclin 1（0.003±0.006）、P-mTOR（0.038±0.019）均低于正常組織[（0.034±0.020）、（0.043±0.015）、（0.023±0.016）、（0.031±0.013）]，而P62（0.029±0.018）、ULK1（0.032±0.014）均高于正常組織（0.020±0.009、0.025±0.010），差異均有統計學意義（P<0.05），腫瘤組織和正常組織的ATG5值分別為（0.034±0.020）、（0.043±0.010），差異無統計學意義（P>0.05）；根據自噬相關蛋白表達水平變化的相關性分析結果，P-mTOR、LC3、P62的表達與ATG7的表達水平變化有關，Beclin 1的表達與其他蛋白不相關，ULK1的表達變化與ATG7和P62相關。結論：自噬的表達水平在腎透明細胞癌中表現為下調狀態，而其下調可受到ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR等多種自噬相關蛋白協同影響。

【關鍵詞】 自噬相關蛋白； 腎透明細胞癌； 癌旁組織； 對比

Expression of Autophagy Related Proteins in Renal Clear Cell Carcinoma and Adjacent Tissues/XIE Qing-ling，XU Gui-bin，YAO Kai，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the expression of autophagy related protein in renal cell carcinoma and adjacent tissues.Method：From March 2016 to March 2017，50 cases with radical nephrectomy were selected as the experimental object.During the operation，part of cancerous tissue and adjacent tissues（normal tissue） of patients were cut out to make specimens which were processed by immunohistochemical staining，made to tissue microarray and measured by IMAGE PRO PLUS6.0 software.Correlation analysis of autophagy related protein expression were conducted.Result：According to the immunohistochemical staining score，ATG7（1.36±0.58），LC3（2.05±0.36），Beclin 1（0.55±0.32） of cancerous tissue were lower than ATG7（2.63±0.78），LC3（3.48±0.45），Beclin 1（2.47±0.69） of adjacent tissues，ULK1 （3.69±0.45），P62（3.54±0.37），P-mTOR（2.99±0.85） of cancerous tissue were higher than ULK1（2.69±0.35），P62（2.31±0.45），P-mTOR（2.05±0.36） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissues and normal tissues were （2.67±0.54），（2.45±0.66），the difference had no statistical significance（P>0.05）.By the measurement results of IMAGE PRO PLUS6.0 software，ATG7（0.029±0.010），LC3（0.021±0.010），Beclin 1（0.003±0.006），P-mTOR（0.038±0.019） of cancerous tissue were lower than ATG7（0.034±0.020），LC3（0.043±0.015），Beclin 1（0.023±0.016），P-mTOR（0.031±0.013） of adjacent tissues，and P62（0.029±0.018），ULK1（0.032±0.014） of cancerous tissue were higher than P62（0.020±0.009），ULK1（0.025±0.010） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissue and normal tissue were （0.034±0.020），（0.043±0.010），the difference had no statistical significance（P>0.05）.From the perspective of correlation analysis，the expression of P-mTOR，LC3，P62 was related to the expression level of ATG7.The expression of Beclin 1 was not related to other proteins.The expression of ULK1 was correlated with ATG7 and P62.Conclusion：The expression level of autophagy is down regulated in renal clear cell carcinoma，and its down-regulation may be affected by ATG7，LC3，Beclin 1，ULK1，P62，P-mTOR and other autophagy related proteins.

【Key words】 Autophagy related protein； Renal clear cell carcinoma； Para-carcinoma tissue； Contrast

First-authors address：The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.001

腎細胞癌屬于惡性腫瘤之一，在泌尿科較為常見。自噬主要是指細胞通過雙層膜或單層膜包裹等待降解物形成自噬體，隨后形成自噬溶酶體，并進行多種酶的降解和消化，從而實現穩定細胞內微環境和實現細胞內成分的更新，其主要標志物為微管相關蛋白1輕鏈3，常參與自噬體的形成[1]。近年來，腫瘤和自噬的關系廣泛受到專家重視，且有研究表明，自噬在腫瘤形成中起到重要作用，且部分學者認為BECLIML在自噬中屬于抑癌基因[2]。而本文旨在探索自噬相關蛋白在腎透明細胞癌與癌旁組織中表達的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次的探索對象為50例實施根治性腎切除術患者，所有患者均在2016年3月

20日-2017年3月20日期間收治。在患者手術中選取一塊正常腎組織和一塊腎癌組織，并將其制作成標本，進行免疫組化染色。其中癌旁組織設定為正常對照，所有患者年齡24～58歲，平均（38.47±3.47）歲，男35例，女15例；TNM分期：Ⅳ期5例，Ⅲ期16例，Ⅱ期14例，I期15例；FUHRMAN 分級：低分化18例，中分化20例，高分化12例。納入標準：（1）均簽署書面同意書；（2）癌旁組織距癌組織邊緣>2 cm；（3）術前未進行過免疫、化療、放療；（4）經病理檢查，患者均確診為腎透明細胞癌。排除標準：（1）心功能不全患者；（2）依從性較差患者；（3）手術禁忌證患者；（4）先天性語言功能障礙或聽力功能障礙患者；（5）危重癥患者；（6）資料不全患者。

1.2 方法 （1）生化試劑：由美國ABCAM公司提供一抗，包括ATG7（ab52472）、ATG5（ab64227）、ULK1（ab65056）、Beclin 1（ab51031）、LC3（ab48394）、P62（ab56416）、P-mTOR（ab51044）。其中P62屬于自噬特異性底物，P-mTOR的活性負性調節自噬，以上兩類蛋白的自噬負和表達相關，而ATG7、ATG5、ULK1、Beclin 1、LC3屬于自噬通路蛋白，其表達的高低能夠反映出自噬含量。由北京中杉金橋公司提供二抗、DAB、檢測試劑盒PV6000，且實施二步法檢測。（2）免疫組化染色和組織芯片：采用QUICK RAY組織芯片制備儀（由韓國UNITMA公司提供）制作組織芯片。首先使用梯度乙醇脫蠟水化后，在雙氧水（3%）中孵育30 min，且封閉內源性過氧化物酶。二抗室溫孵育30 min；一抗在溫度為4 ℃環境下過夜，蘇木精復染，DAB染色。

1.3 觀察指標與評定標準 使用兩種方法對結果進行判定：（1）使用IMAGE PRO PLUS6.0軟件對組織染色程度進行測量，同時再進行統計學分析；（2）由醫生對標本進行染色結果判定，且根據標本染色程度，進行0～4分的標準打分，判定依據為顏色深淺。對比癌組織和正常組織的免疫組化染色評分以及IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結果。分析自噬相關蛋白表達水平變化的相關性分析P值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗和相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常組織和癌組織免疫組化染色評分比較 腫瘤組織的ATG7、LC3、Beclin 1水平均低于正常組織，ULK1、P62、P-mTOR均高于正常組織，差異均有統計學意義（P<0.05），而ATG5含量對比，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 正常組織和癌組織免疫組化染色IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結果比較 腫瘤組織和正常組織ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR含量對比，差異均有統計學意義（P<0.05），而ATG5含量對比，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 自噬相關蛋白表達水平變化相關性分析 Beclin 1

的表達與其他蛋白不相關，ULK1的表達變化與ATG7和P62相關，P-mTOR、LC3、P62的表達與ATG7的表達水平變化有關。

3 討論

在腫瘤進展、發生過程中，為了維護細胞增殖，需大量的氧氣和營養物質。而自噬便屬于腫瘤細胞代謝應激和抵抗缺氧的原因，在腫瘤缺乏營養素時，通過增強自噬，無法觀察到較高的血管化區域[3]，反而言之，自噬的激活能夠產生腫瘤生長必須的底物和能量，其可利于腫瘤細胞的繁殖、生存。同時腫瘤的缺氧化狀態，可導致預后較差，且促使血管的凋亡，形成腫瘤組織[4]。腫瘤的中心缺氧，還可促進侵襲細胞存活，誘導自噬。常規情況下，在BH3區域中，BCL-2和BCL-XL形成復合物，當機體處于缺氧狀態，可促使Beclin 1轉化為BNIP3，從而釋放Beclin 1誘導自噬激活，克服缺氧[5]。

自噬能夠維持基因穩定性，給予細胞提供額外的ATP，及時清除受損細胞和回收失活蛋白[6]。當機體代謝壓力達到一定程度時，可過度激活自噬，從而促使細胞凋亡、死亡，此點能夠證實，對于腫瘤細胞而言，自噬具有較為重要的意義，大部分腫瘤細胞均存在凋亡障礙，由此說明，下調的自噬能夠營造良好的腫瘤生長環境，且本次研究中，也證實了自噬特異性底物P62的積累，能夠促進腫瘤的生長[7]。同時本次研究還可發現，腎細胞中較低的自噬相關蛋白的表達和較少的自噬數量，能夠表明自噬在腎透明細胞癌中的發展、發生意義，提示自噬水平在腫瘤組織中下調[8]。

目前臨床上，對于自噬的調控機制尚未闡述清楚，部分學者認為調節自噬的閥門為mTOP復合物活性[9]。Beclin 1被臨床學者認為其是自噬體起始的階段成分之一，屬于一種腫瘤抑制因子，有研究表明，自噬體的形成是由于Beclin 1的嚴重缺乏。本次研究中發現，Beclin 1和mTOP在腫瘤組織表達中均存在改變現象，其提示著自噬水平下調[10]。而本次研究也發現ATG7和LC3也發生一定意義的改變，其主要提示著機體存在潛在的調控位點[11]。無論是遺傳性腎癌還是散發性腎癌，VHL（VON HIPPEL-LINDAU）基因突變起到較為重要作用，VHL基因突變是導致缺氧誘導因子的聚集，而mTOR通路上調的主要原因為缺氧誘導因子聚集，因此腎癌自噬調低的主要原因為VHL基因突變[12]。

自噬在腫瘤治療中存在較多爭議，有研究報道，自噬通過基因敲除和藥物抑制，能夠改善化療藥物耐受性，助于疾病的恢復，在機體內存在長期影響性，但此項結果有待進一步考察[13]。近年來，臨床發現多種mTOR抑制劑已開始廣泛應用于臨床，且常用于治療晚期腎癌患者，其主要療效為通過調節自噬來達到治療效果[14]。通過分析多項研究報道，發現目前已有多項化合物已被證實，能夠促使腫瘤自噬性細胞的凋亡，包括一種特異性對VHL缺乏腎腫瘤的小分子化合物，其促使自噬性細胞死亡稱為潛在治療方案，但具體療效，還有待證實[15]。

在腎癌患者中，自噬相關基因的表達與癌癥分期、分級有關，主要體現為LC3含量的表達，有研究報道，在卵巢癌患者中，LC3的表達與病理分級和病理類型物統計學意義，其證明在不同腫瘤類型中，自噬的表達存在差異性的[16]。而本次研究中，LC3蛋白表達量與分期、分級存在差異性，從分期角度分析，轉移性腎癌患者和進展性腎癌患者比局限性腎癌患者的LC3蛋白更低，其證實了自噬活體的降低與腎透明細胞癌的侵襲、發生、發展起到一定作用性，總而言之，自噬的抑制能夠作為進展期腎癌的一個標志物[17-18]。

本次實驗主要結合了免疫組織化學技術和組織芯片，從而證實了自噬相關蛋白和腫瘤組織變化有關，其中ATG7、LC3、Beclin 1呈現為下調趨勢[19]，P62、P-mTOR在腫瘤組織中呈現為上調，結合電鏡，可了解到腫瘤細胞內自噬體數量少于正常組織[20]，而此種下調與多種自噬相關蛋白表達有關，結果提示自噬在腎透明細胞癌中表達水平下調，同時為潛在、新型的治療方式提供了實驗基礎[21]。

總而言之，Beclin 1、ULK1、ATG7、P-mTOR、LC3、P62是影響自噬相關蛋白下調的主要原因，而自噬蛋白在腎透明細胞癌中具有重要利用價值，且主要呈現為下調狀。

參考文獻

[1]朱少群，鐘美花.磁共振成像技術在18例臂叢神經損傷診斷中的應用[J].中國民族民間醫藥，2016，25（4）：115，117.

[2]唐怡.ART1調節饑餓誘導的結腸癌細胞自噬及其對癌細胞增殖凋亡影響的研究[D].重慶：重慶醫科大學，2015.

[3]宋孟锜，薛寅凱，孫運秀，等.自噬相關哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、微管相關蛋白1輕鏈3-β在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義[J].中華實驗外科雜志，2014，31（5）：1108-1110.

[4]吳楠，閔鶴鳴，屈惠瑩，等.自噬基因pULK、PI3KC3在非小細胞肺癌中的表達及相關性研究[J].天津醫藥，2015，56（6）：635-638，706.

[5]趙亞通，劉超，龐志剛，等.叉頭轉錄因子O亞家族1及自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ在肝癌組織的表達及意義[J].中華實驗外科雜志，2016，33（2）：492-494.

[6]沈蕓，向陽，肖長紀，等.轉錄因子c-Jun對甲氨蝶呤耐藥絨毛膜癌細胞內自噬標志蛋白LC3的調節作用[J].中華婦產科雜志，2014，8（7）：531-535.

[7]郭凱，黃波，王曉東，等.自噬相關蛋白在肺鱗癌和腺癌組織中的表達及相關性研究[J].天津醫藥，2014，74（6）：536-539.

[8]邵樂寧，楊曉東，邢春根，等.腫瘤相關巨噬細胞自噬狀態對人大腸癌細胞凋亡的影響[J].中華實驗外科雜志，2014，31（7）：1504-1507.

[9]陳佳，王琪，張瑋，等.下調MTRR基因表達對順鉑耐藥的卵巢上皮性癌細胞自噬和凋亡的影響及機制研究[J].中華婦產科雜志，2016，51（4）：285-292.

[10]劉永青.自噬在天然小分子化合物促進前列腺癌細胞死亡中的作用及其機制研究[D].濟南：山東大學，2015.

[11]許赤，蔡惠寧，李翠平，等.RNA干擾技術下調營養缺乏自噬因子1表達對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響[J].中華細胞與干細胞雜志（電子版），2016，6（2）：80-85.

[12]斯慶圖娜拉.聯合自噬抑制劑增加PI3K/mTOR抑制劑NVP-BEZ235誘導的結腸癌細胞凋亡[J].中國實驗診斷學，2015，85（10）：1632-1635.

[13]薛妮娜.新型HSP90抑制劑篩選及抗胰腺癌增殖作用和分子機制研究；SHP90抑制劑誘導胰腺癌細胞IGF-1Rβ自噬性降解的分子機制研究[D].北京：北京協和醫學院中國醫學科學院，2015.

[14]宋建，梁素美，高俊，等.自噬基因LC3B在肺鱗癌中的表達意義及與窖蛋白-1的關系[J].中華臨床醫師雜志（電子版），2013，78（22）：10 029-10 034.

[15]馬泰.細胞自噬在肝癌細胞內質網應激性死亡中的作用及對藥物敏感性的影響[D].合肥：安徽醫科大學，2013.

[16]馮仰偉.自噬相關基因Beclin-1、LC3和增殖細胞核抗原Ki-67在子宮內膜腺癌組織中的表達及意義[D].泰山：泰山醫學院，2015.

[17]張澤兵，全海英，張桐菲，等.自噬在Tca83細胞中的作用及自噬相關基因的表達[J].中華口腔醫學雜志，2012，47（z1）：233-238.

[18]朱興春，劉青松，楊慧敏，等.末端結合蛋白1（EB1）在宮頸組織中的表達及其對自噬標志蛋白表達的影響[J].復旦學報（醫學版），2014，41（5）：641-646.

[19]范大為，劉凱，袁成剛，等.Beclin-1與EZH2在腎透明細胞癌中的表達及其意義[J].新醫學，2016，47（5）：329-334.

[20]倪曉辰，趙志紅，馬永良，等.檜木醇誘導人腎透明細胞癌786-O細胞凋亡及其機制研究[J].中國腫瘤臨床，2015，45（1）：43-46.

[21]張琦，Shuhui Si，Sue Schoen，等.自噬對Folliculin基因缺陷的腎癌細胞放療敏感性的影響[J].泌尿外科雜志（電子版），2015，52（3）：16-22，54.

（收稿日期：2017-04-11） （本文編輯：鄧朝陽）