牙鲆早期胚胎發育的鹽度脅迫研究

段秀娟　馬玉和　任延軍

摘 要：研究了鹽度對牙鲆受精卵的沉浮性及早期胚胎發育的影響。結果表明：受精卵在海水鹽度30以上為浮性，鹽度27.5時為懸浮，鹽度25以下為沉性；孵化期適鹽范圍為25～45，最適鹽度范圍為30～35；在鹽度15～20和45～50下，牙鲆受精卵孵化率顯著下降，仔魚的畸形率大幅上升；牙鲆原腸期對鹽度變化的耐受力高于囊胚期，囊胚期高于4細胞期。

關鍵詞：牙鲆；鹽度；早期；胚胎發育

中圖分類號：S917 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.010

Abstract： The effect of different salinity on floating natures and early embryo development of fertilized eggs from Paralichthys olivaceus breed in sea water were studied. The research results showed that fertilized eggs floating in seawater with salinity above 30， 27.5 as a state of suspension， sinking under the salinity 25. Suitable salinity ranged from 25 to 45 in incubation period， and the optimum salinity ranged from 30 to 35. Hatching rate of fertilized eggs dropped significantly and deformity rate rose in juveniles with the salinity 15 ～ 20 and 45 ～ 50. The tolerance from salinity variation in gastrula stage was better than blastula stage and the blastula stage was better than 4 cells stage.

Key words： Paralichthys olivaceus； salinity； early stage； embryo development

鹽度是影響海水魚類胚胎和初孵仔魚生長、發育的重要因素，不同種類的胚胎和初孵仔魚的鹽度耐受力不同，因此，研究適宜的環境鹽度條件對于魚類的孵化和培育具有重要意義。目前已大量報道了鹽度對魚類胚胎發育和仔魚生長及存活的影響[1-6]。雷霽霖等[1]用人工配制的不同鹽度海水培養黑鯛（Sparus macrocephalus）受精卵，對其胚胎發育、仔魚孵化和卵黃囊消失等方面進行了觀察研究，為鯛科魚類的人工育苗積累了技術參數；王國恩[7]研究了鹽度對鳀屬（Coilia nasus）胚胎發育和孵化的影響；孫麗華等[8]報道了鹽度對軍曹魚（Rachycentron canadum）胚胎和仔魚發育的影響；王涵生等[9]研究了溫度、鹽度對牙鲆受精卵孵化率及仔魚存活率的影響；王宏田等[10]研究了牙鲆的胚胎發育以及初孵仔魚的鹽度耐受力。但關于鹽度對各階段牙鲆胚胎發育的影響尚未見報道。在實際生產中，由于降水、蒸發等原因導致的海水鹽度變化時有發生，對發育中的牙鲆胚胎將會產生影響，應對此影響進行深入的了解和評估，本試驗以牙鲆胚胎為材料，研究鹽度對其胚胎不同發育階段的影響，旨在為牙鲆苗種培育提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

雌雄親魚均為5齡，雌魚體長55 cm，體質量約2 550 g，雄魚體長45 cm，體重約1 850 g。試驗魚卵采自同一尾雌魚，約36 000粒，精子采自一尾雄魚，約3.0 mL。經人工授精獲得受精卵。

配置鹽度5，10，15，20，25，30，35，40，45和50的海水，pH值為7.8～8.2，水溫15.5～17 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工受精 采用干法授精，將采集的精子經鏡檢確認活力好后加入放有牙鲆卵的燒杯中，輕輕晃動燒杯使精卵混合，加入16 ℃海水200 mL激活受精，2 min后加入500 mL海水稀釋受精卵，待受精卵充分上浮后，過濾并用海水沖洗數次，受精卵放入網箱（孔徑為0.19 mm）中，孵化鹽度為33。

1.2.2 胚胎的沉浮性及胚胎的鹽度耐受力 用6個1 000 mL的燒杯分別裝入鹽度為20，22.5，25，27.5，30，32.5的海水1 000 mL，每個燒杯中放入100粒牙鲆受精卵，靜置30 min，觀察其沉浮。試驗設3個平行。

設置5，10，15，20，25，30，35，40，45，50共10個鹽度梯度，每個鹽度梯度各設3個平行，每個平行水體為20 cm×20 cm×10 cm。當受精卵發育到4細胞、囊胚期和原腸期時，分別放到10個鹽度梯度試驗組中孵化，每組200粒卵。

顯微觀察胚胎發育，各組達到原腸期后，從受精卵中隨機抽取200粒，統計受精率；至完全孵化，統計孵化率、畸形率。

1.2.3 數據處理 受精率=原腸期時正常胚胎數/總卵數×100%；孵化率=初孵仔魚數/受精卵數×100%；畸形率=畸形仔魚數/初孵仔魚總數×100%。

試驗數據利用SPSS11.5進行單向方差分析（One way ANOVA），對不同數據組之間均值利用LSD做差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 受精卵的沉浮性

水溫15.5～17.5 ℃時，海水鹽度25以下受精卵表現為完全沉性；鹽度27.5時表現為半沉浮狀態，大部分受精卵懸浮于水體中間；鹽度30以上則表現為完全浮性。

2.2 鹽度對各期胚胎發育及孵化的影響

2.2.1 鹽度對4細胞胚胎孵化的影響 4細胞時，牙鲆受精卵的孵化率見表1。鹽度30～40，3個試驗組的平均孵化率最高達91%。鹽度30，35，40時，孵化率無顯著差異；鹽度25和45時孵化率無顯著差異；鹽度25和50時孵化率無顯著差異；鹽度15和20時孵化率無顯著差異；鹽度為25和45時，各組受精卵的孵化率較鹽度30～40時降低12%～23%；25和50鹽度組的孵化率降幅為18%～26%；15和20鹽度組的孵化率降幅為17%～45%；而5鹽度組的孵化率為0。

2.2.2 鹽度對囊胚期胚胎孵化的影響 如表2所示，囊胚置入不同鹽度海水中，鹽度30～40范圍內3個試驗組的平均孵化率最高達93%。30，35，40這3個鹽度組之間孵化率無顯著差異；25和45鹽度組之間孵化率無顯著差異；40和45鹽度組之間孵化率無顯著差異；鹽度為15，20， 25，50時，各組受精卵的孵化率較鹽度30～40時降低17%～37%；而5鹽度組的孵化率為0.12%。

2.2.3 鹽度對原腸期胚胎發育及孵化的影響 如表3，原腸期牙鲆胚胎置入不同鹽度海水中，鹽度30～45范圍內4個試驗組的平均孵化率最高達96%。30，35，40，45這4個鹽度組之間孵化率無顯著差異；25和50鹽度組之間孵化率無顯著差異；15和20鹽度組之間孵化率無顯著差異；鹽度為25和50時，各組受精卵的孵化率較鹽度30～45時降低16%～26%；15和20鹽度組的孵化率降幅為39%～44%；而5鹽度組的孵化率為2.74%。

2.2.4 各個胚胎發育時期孵化率的比較 如圖1，牙鲆的適宜孵化鹽度范圍為25～45，最適孵化鹽度范圍為30～35。在最適孵化鹽度范圍內，4細胞、囊胚期、原腸期的孵化率分別為83.56%～90.52%、84.83%～92.32%、87.70%～95.15%，4細胞、囊胚期、原腸期對鹽度的耐受力逐漸增強。

2.2.5 鹽度與牙鲆初孵仔魚的畸形率 如表4，3個平行組中牙鲆初孵仔魚的畸形率均在30～35范圍內最低，30，35 ，40這3個鹽度組之間畸形率無顯著差異；鹽度低于25和高于40時畸形率隨鹽度進一步降低或升高而顯著升高。

3 結論與討論

3.1 鹽度與受精卵的沉浮性

牙鲆受精卵具有典型硬骨魚類浮性卵的特性，中央油球能使卵子漂浮于一定鹽度的海水中。其沉浮性與黑鯛、真鯛等海水魚類受精卵在不同鹽度的沉浮狀態相似[11]，但與其他海水魚類胚胎發育的適鹽范圍差別較顯著（表5）。

3.2 鹽度與早期胚胎發育

牙鲆胚胎發育的最適鹽度范圍為30～35，適宜鹽度范圍為25～45。而鹽度15～20和45～50可分別視為牙鲆受精卵孵化在低鹽區和高鹽區的兩個臨界鹽度區域，在此臨界鹽度上下，牙鲆受精卵孵化率和仔魚畸形率均表現出明顯的不同。因此，在牙鲆人工繁殖時，海水鹽度低于25時，要適當調高孵化水鹽度，并保持連續充氣，使卵子處于懸浮狀態[16]。

另外，魚類孵化適宜鹽度范圍不僅具有種間差別（表5），且與其各自的生態習性有關，如尖吻鱸為廣鹽性魚類，人工繁殖時受精卵孵化率在鹽度11～40范圍內均無顯著差別；真鯛和高體獅均是外海洄游性魚類，但真鯛的最適孵化鹽度范圍為28.1～32.7，而高體獅孵化的最適范圍比較窄，僅為32～35[17]。牙鲆亦屬外海洄游性魚類，Ditty 等調查墨西哥灣自然海區中牙鲆卵主要分布于鹽度28.5～34.1區域，這與大亞灣海區人工培育的牙鲆受精卵孵化的最適鹽度范圍相近。

3.3 鹽度與牙鲆受精卵的孵化率

試驗觀察發現，在鹽度為25～45的范圍內，牙鲆受精卵保持著較高的孵化率，但孵化速度不同，在鹽度為25和40時，孵化速度較快，因此，牙鲆受精卵孵化時對鹽度的適應性很強。在25～45的鹽度范圍內牙鲆受精卵的發育時序、孵化率無顯著差別，受精卵的胚胎發育基本不受鹽度影響，這為牙鲆的人工育苗提供了寬松的鹽度要求。

在不同鹽度下，原腸期牙鲆胚胎孵化率均高于4細胞和囊胚期，原腸期對鹽度的耐受力更強，與朱鑫華等人的研究結果基本一致[18]。大菱鲆胚胎在原腸后期會出現大量死亡，牙鲆胚胎的生命力較強，保持水溫穩定和水質良好不會輕易死亡。牙鲆胚胎對鹽度的耐受力隨著發育時期的推進而增加，原腸期對鹽度變化的耐受力高于囊胚，越接近胚胎發育的后期，對鹽度變化的適應力也越強。

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