南極德雷克海峽表層海水酵母菌多樣性研究

李昭 王偉 郝建華 孫謐

摘 要：為了研究德雷克海峽的微生物多樣性，采集南極德雷克海峽表層海水，通過傳統分離培養法獲得可培養的酵母菌株，對其18S rDNA保守序列進行測序及系統發生分析。結果表明：共分離出45株酵母菌，屬于9個屬，12個種；其中，優勢屬為Meyerozyma屬，優勢種為Meyerozyma guilliermondii。對所有菌株的過氧化氫酶活性進行檢測，發現23株酵母菌具有強烈的過氧化氫酶活性，13株具有弱過氧化氫酶活性，即可分解過氧化氫的菌株占總菌株數的80%。

關鍵詞：可培養酵母菌；18S rDNA；過氧化氫酶

中圖分類號：Q938.8 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2017）01-0068-05

Abstract：In order to study microbial diversity in the surface seawater of the Drake Passage in Antarctic， 7 surface seawater samples were collected to isolate the strains of culturable yeast by the traditional method， and 18S rDNA sequencing and phylogenetic analyses were carried out. The results showed that 45 yeast strains were isolated and there were 9 genera and 12 species. Meyerozyma sp. and Meyerozyma guilliermondii was the dominant genera and species. The results of the catalase activities showed that 23 strains were strong catalase positive， 13 strains were weak， and 80% strains were catalase positive.

Key words：culturable yeast； 18S rDNA； catalase

德雷克海峽是世界上最寬的海峽，位于南美南部的火地島和南極半島之間，是溝通太平洋和大西洋水體的唯一通道[1]。在對環南極所有海域表層海水葉綠素a和初級生產力的研究中發現，德雷克海峽表層海水的葉綠素a含量和初級生產力均最低[2]。在南極水域的4個海區中，德雷克海峽的硅含量（Si/P僅3.34）和顆粒有機碳（POC）濃度（<100 pg/dm3）也是最低的。這些都可能成為微生物生長的限制因子[3]。目前，關于德雷克海峽微生物多樣性的研究報道較少。

過氧化氫是一種強氧化劑，產生于生物代謝過程的氧化還原反應，它可以輕易的穿過細胞壁或質膜等細胞結構，并通過氧化蛋白質的巰基和斷裂核酸單鏈而傷害到組織或細胞的任一部位[4]。生活在有氧環境中的生物通常都有可以專門消除過氧化氫的生物抗氧化保護劑——過氧化氫酶，該酶具有較高的催化效率，可確保過氧化氫被迅速分解而不損傷有機體[5]。因此，在生物演化過程中該酶逐漸成為生物防御系統的關鍵酶之一[6-8]。

1 材料與方法

1.1 采樣位置及樣品處理

試驗所用樣品取自南極德雷克海峽表層海水，采樣時間為2012年3月。共收集7個站點的表層海水樣品（圖1），其中44#、34#、5# 和15#號站點位于采樣區域的邊緣，49#號站點位于采樣區域的中心位置，6#號為5#的對比站點，42#號為49#號的對比站點，這樣的采樣區設置使得試驗結果更加準確可信。取樣后2 h內在無菌操作室中將樣品抽濾過0.2 μm微孔濾膜，將濾膜置于無菌的4 mL離心管中，加入甘油后于-80℃保存[9]。

1.2 菌株的分離培養、純化及保種

在無菌條件下，用2 mL滅菌海水反復沖洗濾膜并渦旋，分別取200 μL涂布于海水R2A培養基、2216E培養基和海水瓊脂培養基平板上，每種培養基涂布2個平板，分別置于4、16和28℃恒溫培養箱中培養至長出可辨認的菌落。根據菌落形態挑取不同

單菌落，進行劃線純化，純化3次后接種于斜面，用15%的甘油保種液洗脫菌苔，-80℃保藏。

1.3 菌株基因組DNA的提取

將菌株接種于相應的培養基平板，在28℃活化培養48 h。用TE緩沖液洗脫菌體，利用酚-氯仿法[10]提取菌株的基因組DNA。

1.4 18S rDNA擴增

酵母菌18S rDNA通用引物[11]：上游引物P1：5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'；下游引物P2：5'-GATCCTTCCGCAGGTTCACC'。PCR退火溫度為52～55℃。PCR 產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA膠回收試劑盒進行回收、純化。

1.5 18S rDNA序列測定及構建系統樹

將所得菌株的18S rDNA 基因PCR產物送北京六合華大生物公司進行測序，出現雜合的樣品進行克

隆[10]后再測序。將所得的18S rDNA序列在NCBI數據庫中運用BLAST程序進行比對后，選取與分離菌株相似度最高的種作為標準株，用MEGA 5.0 軟件以鄰接法構建系統進化樹，用自舉法（Bootstrap method）使用1 000次自展測試進化樹的可靠性。

將所有菌株的18S rDNA 序列提交至GenBank，獲得的序列號為KR336835-KR336846。

1.6 降解過氧化氫（H2O2）

對所有菌株進行過氧化氫酶活性檢測[12]，陽性的為具有降解H2O2能力的菌株，陰性的則不能降解H2O2。

2 結果與分析

2.1 菌株的選取、DNA的提取和PCR擴增

待海水R2A培養基、2216E培養基和海水瓊脂培養基平板上長出菌落后，根據菌落特征、菌絲、孢子等形態學特點，共挑取菌株45株，其中5#號站點2株，6#號站點7株，15#號站點5株，34#號站點10株，42#號站點4株，49#號站點9株，44#號站點8株。

提取菌株基因組DNA，PCR擴增18S rDNA基因后電泳，均能得到長度約為1.8 kb的單一條帶。

2.2 可培養菌株的鑒定

BLAST比對分析結果顯示，分離所得的45株酵母菌中，共包含了9個屬，12個種（表1）。優勢屬為Meyerozyma屬（季也蒙酵母屬），占總菌株數的40%；其他8個屬分別為Rhodosporidium屬（紅冬孢酵母屬）、Candida屬（假絲酵母屬）、Rhodotorula屬

（紅酵母屬）、Cryptococcus屬（隱球酵母屬）、Trichosporon屬（絲孢酵母屬）、Leucosporidium屬、Debaryomyces屬（德巴利氏酵母屬）和Cystofilobasidium屬（圖2）。優勢種為Meyerozyma guilliermondii，占總菌株數的40%；其他11個種分別為Trichosporon pullulans （茁芽絲孢酵母菌）、Rhodotorula glutinis （粘紅酵母菌）、Leucosporidium scottii、Cryptococcus peneaus、Cryptococcus psychrotolerans、Candida austromarina、Candida zeylanoides （涎沫假絲酵母菌）、Candida membranifaciens （璞膜假絲酵母菌）、Debaryomyces hansenii （漢遜德巴利氏酵母菌）、Cystofilobasidium infirmominiatum和Rhodosporidium diobovatum（圖3）。

2.3 可培養菌株的系統進化樹

由圖可知4，Debaryomyces屬（德巴利氏酵母

（Nc49HB-1類：Nc49HB-1/ Nb15MB-1/ Na6RA-1/ Nb6HB-1/ Nb6MA-1/ Na34RB-1/ Na34HA-1/ Na34HA-2/ Nb34MB-1/ Nb44HA-1/ Na49RB-1/ Na49MB-1/ Na5HA-1/ Na5RB-1/ Nc44RA-1/ Nc44RB-2/ Nc44MA-1/ Nc44HB-1，共18個菌株； Nc42MB-2類：Nc42MB-2/ Nc6HA-2/ Nc6HB-2，共3個菌株； Nc15MB-3類：Nc15MB-3/ Nb34RB-3/ Nc34RB-2/ Nc34MA-3，共4個菌株； Na49MA-1類：Na49MA-1/ Na49MB-3/ Nc44RA-3/ Nc44MB-3/ Nb49MA-3/ Nb49MB-3，共3個菌株。）

（假絲酵母屬）處于同一進化分枝，Trichosporon屬（毛孢子菌屬）、Cystofilobasidium屬和Cryptococcus屬（隱球酵母屬）處于同一進化分枝，Leucosporidium屬（白冬孢酵母屬）、Rhodotorula屬（紅酵母屬）和（紅冬孢酵母屬）處于同一進化分枝。Candida屬（假絲酵母屬）的3個種處于同一進化分枝，Cryptococcus屬（隱球酵母屬）的2個種也處于同一進化分枝。

2.4 降解過氧化氫（H2O2）

對獲得的45菌株進行過氧化氫酶活性檢測，具體結果見表1。經統計，45株真菌菌株中，23株具有強烈的過氧化氫酶活性（+），占總菌株數的51%；13株具有弱過氧化氫酶活性（W），占總菌株數的29%；9株沒有過氧化氫酶活性，占總菌株數的20%。12個種中有11個種都有不同程度的過氧化氫酶活性，只有璞膜假絲酵母菌（Candida membranifaciens）種沒有菌株有過氧化氫酶活性。

3 討 論

采用可培養的方法對采自南極德雷克海峽7個站點的表層海水樣品中酵母菌種類和多樣性進行了初步研究，結果顯示，7個樣品中共分離出酵母菌45株，分別屬于9個屬，12個種。

至今為止，從南極土壤、海水、空氣等樣品中所獲得的酵母菌多為Penicillium屬（青霉屬）、Cladosporium屬（枝孢霉屬）、Chrysosporium屬（金孢霉屬）、Aspergillus屬（曲霉屬）、Candida屬（假絲酵母屬）、Rhodotorula屬（紅酵母屬）、Geomyces屬（地絲霉屬）、Metschnikowia屬（梅奇酵母屬）、Cryptococcus屬（隱球酵母屬）等，另外還包括Streptomyces屬（鏈霉菌屬）、Torulopsis屬（球擬酵母屬）、Cephalosporium屬（頭孢霉屬）、Eurolium屬（散子囊菌屬）、Meyerozyma屬（季也蒙酵母屬）、Leucosporidium屬（白冬孢酵母屬）、Rhodosporidium屬（紅冬孢酵母屬）、Cystofilobasidium屬等[13-21]。該試驗所獲得的大多數種屬在南極其他地區也曾發現過[15，18-19，21]，但Trichosporon屬（毛孢子菌屬）和Debaryomyces屬（德巴利氏酵母屬）卻鮮有發現。

在優勢菌群方面，試驗中優勢屬為Meyerozyma屬

（季也蒙酵母屬），優勢種為Meyerozyma guilliermondii，這與上述文獻報道也并不相同，原因可能是因為上述文獻大多采用營養較為豐富的土豆培養基（PDA），且采用較低溫度培養（多為4～20℃），而該試驗采用了3種寡營養培養基，以及3個不同梯度的培養溫度，在模擬南極表層海水低溫、寡營養環境的同時，盡量提供多種不同的培養環境，以期得到更多不同類型的菌株，使得研究結果更加可信。該試驗中優勢種Meyerozyma guilliermondii占到總菌株數的40%，且在3種培養基、3種培養溫度下都能得到，這些都從側面

反映出Meyerozyma guilliermondii適應環境的能力較強。

表層海水中溶解的有機碳受到紫外線的光化學激活作用從而產生過氧化氫[22-25]，由于大氣中的臭氧層“空洞” 南極地區紫外輻射較強烈，因此南極地區表層海水中必然富集了大量的過氧化氫。過氧化氫是一種活性氧化劑，具有細胞毒性，可以引發海洋微生物的氧化應激反應[26]，導致微生物中的膜脂[27-28]、蛋白質[29]、核酸[30]等的氧化性損傷，從而擾亂細胞膜的運輸[31-33]，妨礙細胞的穩定性[25，34-35]。由此推測，南極海水中的微生物必然可以產生過氧化氫酶，以抵抗過氧化氫對于微生物的毒害。試驗中發現，南極德雷克海峽可培養酵母菌中具有過氧化氫酶活性的比例非常高，達到總菌株數的80%，也印證了這一推測。過氧化氫酶除了能夠幫助微生物抵抗過氧化氫的毒害之外，在人類的生產中也有著廣泛的應用。例如：在食品工業中，牛奶或液體雞蛋制品通常使用過氧化氫來消毒， 而過氧化氫酶可以去除殘余的過氧化氫；在環保行業中，用過氧化氫酶取代化學試劑降解工業廢水中含有的過氧化氫，避免二次污染， 同時也可以降解芳環化合物和脂族化合物。

參考文獻：

[1]吳水根，呂文正. 德雷克海峽的擴張歷史及其影響[J]. 南極研究，1988，1（2）：1-7.

[2]劉子琳，寧修仁，蔡昱明，等. 1999/2000年夏季環南極表層海水葉綠素a和初級生產力[J]. 極地研究，2000，12（4）：235-244.

[3]劉子琳，寧修仁，朱根海，等. 南大洋環極表層水浮游植物分級生物量、初級生產力和顆粒有機碳的分布[J]. 南極研究，1993，5 （4）：63-72.

[4]Klotz M G，Loewen P C. The molecular evolution of catalaic hydroperoxidases：evidence for multiple lateral transfer of genes between prokaryota and from bacteria into eukaryota[J]. Molecular Biology and Evolution，2003，20（7）：1098-1112.

[5]王 偉，孫 謐，劉萬順. 單功能過氧化氫酶的高級結構[J]. 中國生物化學與分子生物學報，2009，24（3）：197-202.

[6]Schrader M，Fahimi H D. Peroxisomes and oxidative stress[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2006，1763（12）：1755-1766.

[7]Zamocky M，Furtmller P G，Obin C. Evolution of catalases from bacteria to humans[J]. Antioxidants & Redox Signaling，2008，10（9）：1527-1548.

[8]劉靈芝，鐘廣蓉，熊 蓮，等. 過氧化氫酶的研究與應用新進展[J]. 化學與生物工程，2009，26（3）：15-18.

[9]李 昭，喬延路，范曉陽，等. 南太平洋環流區深海底層水可培養細菌多樣性研究[J]. 海大學報自然版，2013，44 （6）：52-59.

[10]李 昭. 南太平洋環流區深海可培養細菌的多樣性研究以及兩株海洋新菌的分類鑒定[D]. 青島：中國海洋大學，2013.

[11]Thanh V N，Van D M S，Wingfield M J. Debaryomyces mycophilus sp. nov.，a siderophore-dependent yeast isolated from woodlice[J]. FEMS Yeast Research，2002，（2）：415-427.

[12]Smibert R M，Krieg N R. Phenotypic characterization. In Methods for General and Molecular Bacteriology [M]. Washington DC：American Society for Microbiology，1994. 607-654.

[13]Marshall W A. Aerial Transport of Keratinaceous Substrate and Distribution of the Fungus Geomyces pannorum in Antarctic Soils[J]. Microbial Ecology，1998，36：212-219.

[14]Tosi S，Kostadinova N，Krumova E，et al. Antioxidant enzyme activity of Wlamentous fungi isolated from Livingston Island，Maritime Antarctica[J]. Polar Biology，2010，33：1227-1237.

[15]Vaca I，Fau'ndez C，Maza F，et al. Cultivable psychrotolerant yeasts associated with Antarctic marine sponges[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29：183-189.

[16]Godinho V M，Furbino L E，Santiago I F，et al. Diversity and bioprospecting of fungal communities associated with endemic and cold-adapted macroalgae in Antarctica[J]. International Society for Microbial Ecology，2013，7：1434-1451.

[17]Zhang T，Zhang Y Q，Liu H Y，et al. Diversity and cold adaptation of culturable endophytic fungi from bryophytes in the Fildes Region，King George Island，maritime Antarctica[J]. Federation of European Microbiological Societies，2013，341：52-61.

[18]Loque C P，Medeiros A O，Pellizzari F M，et al. Fungal community associated with marine macroalgae from Antarctica[J]. Polar Biology，2010，33：641-648.

[19]Duarte A W F，Dayo-Owoyemi I，Nobre F S，et al. Taxonomic assessment and enzymes production by yeasts isolated from marine and terrestrial Antarctic samples[J]. Extremophiles，2013，17：1023-1035.

[20]靳永軒，叢柏林，王能飛，等. 南極阿德雷島不同基底中真菌的分離培養及初步鑒定[J]. 極地研究，2013，25（1）：71-77.

[21]丁新彪，叢柏林，張 揚，等. 南極普里茲灣及鄰近海域沉積物微生物多樣性與生理生化研究[J]. 海洋科學進展，2014，32（2）：209-218.

[22]Cooper W J，Zika R G. Photochemical formation of hydrogeti peroxide in surface and ground watcrs exposed to sunlight[J]. Science，1983，220：711-712.

[23]Moffett J W，Zafiriou O C. An investigation of hydrogen peroxide chemistry in surface waters of Vineyard Sound with H218O2 and 18O2[J]. Limnology and Oceanography，1990，35：1221-1229.

[24]Karl D M，Resing J，Tien G，et al. Palmer LTER：Hydrogcn peroxide in the Palmer LTER region：I. An introduction[J]. Antarctic Journal of the United States，1993，28：225-226.

[25]Abele D，Burlando B，Viarengo A，et al. Exposure to elevated temperatures and hydrogen peroxide elicits oxidative stress and antioxidant response in the Antarctic intertidal limpet Nacella concinna[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，1998，120B：425-435.

[26]Viarengo A，Abele-Oeschgder D，Burlando B. Effects of low temperature on prooxidants and antioxidant defence systems in marine organisms [M]. Cambridge：Cambridge University Press，1998. 213-235.

[27]Thomas C E，Reed D J. Radical-induced inactivation of kidney Na+，K+，-ATPase：sensitivity to membrane lipid peroxidation and the protective effect of vitamin E[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，1990，281：96-105.

[28]Stark G. The effect of ionizing radiation on lipid membranes[J]. Biochimica et Biophysica Acta. 1991，1071：103-122.

[29]Neuzil J，Gebicki J M，Stocker R. Radical-induced chain oxidation of proteins and its inhibition by chain-breaking antioxidants[J]. Biochemical Journal，1993，293：601-606.

[30]Schulte-Frohlinde D，Sonntag V C. Radiolysis of DNA and model systems in the presence of oxygen[A]. Heimut S. Oxidative stress[C]. London：Academic Press，1985. 11-40.

[31]Jones D P. The role of oxygen concentration in oxidative stress：hypoxic and hyperoxic models[A]. Heimut S. Oxidative stress[C]. London：Academic Press，1985. 151-195.

[32]Hitschke K，Buhler R，Apell H J，et al. Inactivation of the Na，K-ATPase by radiation-induced free radicals. Evidence for a radical-chain mechanism[J]. Febs Letters，1994，353：297-300.

[33]Mense M，Stark G，Apell H J. Effects of free radicals on partial reactions of the Na，K-ATPase[J]. Journa1 of Membrane Biology，1997，156：63-71.

[34]Boraso A，Williams A J. Modification of the gating of the cardiac sarcoplasmic reticulum Ca（2+）-release channel by H2O2 and dithiothreitol[J]. American Journal of Physiology，1994，267：H1010.

[35]Abele-Oeschger D，Sartoris F J，Portner H O. Effect of elevated hydrogen peroxide levels on aerobic metabolic rate，lactate formation. ATP homeostasis and intracellular pH in the sand shrimp Crangon crangon[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，1997，117C：123-129.

（責任編輯：成 平）