DAPT對骨肉瘤U2OS細胞增殖和凋亡影響的實驗研究

胡國海　代國　劉蓋為

[摘要] 目的 觀察γ-分泌酶抑制劑DAPT對人骨肉瘤細胞系U2OS增殖和凋亡的影響，探討DAPT抑制骨肉瘤增殖并誘導其凋亡的可能機制。 方法 采用體外培養人成骨肉瘤細胞系U2OS，CCK-8法檢測不同濃度DAPT對成骨肉瘤細胞系U2OS生長的抑制作用；Annexin V-FITC/PI雙標染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Hoechst 33258染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態學變化；應用RT-PCR和Western blot法檢測DAPT對凋亡通路相關mRNA和蛋白表達的影響；采用Caspase活性檢測試劑盒檢測Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性變化。 結果 CCK-8檢測顯示5～50 μmol/L的DAPT可抑制人骨肉瘤U2OS細胞增殖并具有時間和劑量依賴性；流式細胞術檢測顯示5、10、20 μmol/L的DAPT可明顯誘導骨肉瘤U2OS細胞發生凋亡，與對照組相比差異有統計學意義（P < 0.05）；5、10、20 μmol/L的DAPT處理后，Hoechst 33258染色可見凋亡小體；RT-PCR和Western blot分析顯示，經DAPT（5、10、30 μmol/L）處理后的骨肉瘤細胞系U2OS表達Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA較對照組明顯增高（P < 0.05），促凋亡蛋白Bax表達增加（P < 0.05），抑制凋亡蛋白Bcl-2表達減少（P < 0.05）；Caspase活性檢測顯示，DAPT（5、10、20、30 μmol/L）處理后，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性較對照組明顯升高（P < 0.05）。 結論 γ-分泌酶抑制劑DAPT對骨肉瘤細胞系U2OS的增殖有顯著抑制作用，并可誘導其發生凋亡，其作用機制可能與激活Caspase依賴的凋亡途徑有關。

[關鍵詞] γ-分泌酶抑制劑；DAPT；骨肉瘤；增殖；凋亡

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0004-06

[Abstract] Objective To observe the effect of gamma secretase inhibitor DAPT on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS， and to explore the possible mechanism of DAPT inhibiting osteosarcoma proliferation and inducing apoptosis. Methods Osteosarcoma cell line U2OS was cultured in vitro. Cell proliferation was tested by cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Double stained by Annexin V-FITC and Propidium Iodide （PI）， the cells were detected by flow cytometry （FCM） for apoptosis. Hoechst 33258 was used to detect the morphological change of typical apoptotic cells. The apoptosis related mRNA and protein levels in U2OS were detected by RT-qPCR and Western blot. The activities of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 were measured with Caspase activity assay kit. Results CCK-8 assay showed that 5-50 μmol/L DAPT inhibited the proliferation of human osteosarcoma U2OS cells and in a time- and dose-dependent manners. Flow cytometry showed that 5， 10 and 20 μmol/L DAPT could significantly induce apoptosis of osteosarcoma U2OS cells， compared to the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Apoptotic body could be observed by Hoechst 33258 staining after treatment with 5， 10 and 20 μmol/L DAPT. RT-PCR and Western blot analysis showed that after treatment with DAPT （5， 10， 30 μmol/L）， the expression of Caspase-3， 8 ，9 mRNA were higher than those of control group （P < 0.05）， the pro-apoptotic protein Bax increased （P < 0.05）， and anti-apoptosis protein Bcl-2 protein decreased （P < 0.05）. The activities of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 promoted obviously after treatment with DAPT （5， 10， 20， 30 μmol/L） when compared with the control group （P < 0.05）. Conclusion DAPT can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS. Its mechanism of action may be related to activation of Caspase dependent apoptosis pathway.endprint

[Key words] γ-secretase inhibitor； DAPT； Osteosarcoma； Proliferation； Apoptosis

骨肉瘤是一種臨床上常見的骨原發惡性腫瘤，起源于間葉組織，占惡性骨腫瘤的20%～45%，以青少年患者居多，易復發和早期發生遠處轉移。自20世紀70年代開始引入新輔助化療的理念，使患者的5年生存率從不足20%提高到65%～70%[1-2]。保肢手術的開展也使患者的生存質量得到顯著改善與提高。但是，骨肉瘤局部復發率并沒有因為新輔助化療而降低，始終維持在10%～20%，伴有肺部轉移的患者5年生存率亦不足20%[3]。近40年來，雖然治療方案在不斷的改進，但仍然無法解決腫瘤復發、轉移及耐藥的問題，這使得骨肉瘤治療處在瓶頸期[2，4]。因而尋找新的或更加有效的治療藥物或治療方式顯得極為緊迫。

研究發現，Notch信號通路在骨肉瘤的發生與發展中起了極為重要的作用[5-6]。Notch基因最早發現于果蠅中，其突變可導致果蠅殘翅而得名，Notch信號是通過細胞-細胞的直接接觸起作用的，當配體與受體結合后，經過2次酶切形成NICD（Notch intracellular domain）前體，關鍵的裂解發生在第3次酶切位點上，由早老素依賴的γ-分泌酶進行，酶切后釋放Notch受體真正的激活形式NICD。隨后，NICD轉移至細胞核內，參與基因調控[7]。γ-分泌酶抑制劑DAPT可有通抑制Notch通路中的關鍵蛋白γ-分泌酶，從而有效抑制Notch的活化。國內外研究表明，DAPT在體外、體內對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用，如卵巢癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌[8-11]。前期研究表明，Notch信號通路在骨骼的發育和骨的重塑中都起到重要作用，Notch信號通路失調會導致骨的發育障礙甚至形成骨肉瘤[12]。還有學者指出，Notch信號通路對促進骨肉瘤發生與轉移也起到關鍵作用[13]。因此，如若通過藥物或者其他方式特異性地阻斷Notch信號通路有可能成為潛在的治療骨肉瘤的靶點。

本研究擬通過應用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路，從而研究DAPT對人骨肉瘤U2OS細胞的增殖抑制作用和誘導凋亡的能力，并進一步檢測了其對凋亡相關通路的影響，旨在為進一步明確γ-分泌酶抑制劑DAPT的抗腫瘤作用提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人骨肉瘤細胞系U2OS購自中國科學院細胞庫（the Cell Bank of Chinese Academy of Sciences，中國，上海）。DMEM培養基、新鮮小牛血清為Hyclone公司產品；γ-分泌酶抑制劑DAPT購自Sigma公司（美國），用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10 mmol/L的儲存液分裝備用，使用時用無血清DMEM培養基稀釋到所需濃度，DMSO的含量小于0.1%；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）購自同仁化學研究所（日本）；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基公司（南京）；DMSO、Hoechst 33258及胰蛋白酶均購自Sigma公司（美國）；Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司（上海）；一抗Bax、Bcl-2和GAPDH均購自CST（美國）公司；BCA檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司（上海）；總蛋白提取試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；垂直電泳儀購自北京六一儀器廠；TRIzol法總RNA提取試劑盒購自Takara（日本）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR相關試劑購于Thermo（美國）公司；所有引物由上海生工合成（上海）。

1.2 細胞培養

用含10%小牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）的DMEM培養液在37℃、5%CO2、95%空氣以及飽和濕度孵育箱中常規培養，每48小時換液一次，用0.25%含EDTA胰酶消化液消化、傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3 CCK-8法檢測DAPT對U2OS細胞增殖的影響

取對數生長期的細胞，制成1×105/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h待其貼壁后加入終濃度分別為5、10、20、30、40、50 μmol/L DAPT，陰性對照組加等體積的DMEM培養液處理（每個濃度設5個復孔），每個濃度處理24、48、72 h后，加入CCK-8 10 μL、培養液90 μL繼續培養2 h，在酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度OD值，實驗重復3次。按公式計算細胞的存活率：細胞存活率=[（As-Ab）]/[（Ac-Ab）]×100%，其中，As為給藥實驗組OD值（含有細胞的培養基、CCK-8、毒性物質），Ac為陰性對照組OD值（含有細胞的培養基、CCK-8、沒有毒性物質），Ab為空白孔OD值（不含細胞的培養基、CCK-8）。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染結合流式細胞儀檢測DAPT對U2OS細胞凋亡的影響

收集處于對數生長期的骨肉瘤U2OS細胞，胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，計數后調整細胞密度為2×105/mL，按2 mL/孔接種于6孔板，37℃、5%CO2、95%空氣以及飽和濕度孵育箱中常規培養24 h，待細胞完全貼壁后吸棄原培養液，加入含有終濃度分別為5、10、20 μmol/L的DAPT新鮮DMEM培養液，同時設立對照組（0 μmol/L DAPT）。藥物作用48 h后，各組重復3次，經胰酶消化，收集細胞于流式管內，1500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，用稀釋好的結合緩沖液（結合緩沖液∶去離子水按1∶10稀釋）90 μL重懸細胞。每管依次加Annexin V-FITC 5 μL，再加入5 μL PI（Propidium Iodide）染色液，輕輕混勻，室溫下避光孵育5 min，上流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。以Annexin V-FITC為橫坐標軸，以PI為縱坐標軸，右上象限代表晚期凋亡的細胞（Annexin V-FITC陽性，PI陽性），右下象限代表早期凋亡的細胞（Annexin V-FITC陽性，PI陰性），左上象限代表壞死細胞碎片（Annexin V-FITC陽性，PI陽性），左下象限代表活細胞（Annexin V-FITC陰性，PI陰性）。endprint

1.5 Hoechst 33258檢測細胞凋亡

選取對數生長期的U2OS細胞接種于6孔板中，行細胞玻璃爬片實驗，采用經CCK-8和流式檢測作用較明顯的5、10、20 μmol/L DAPT分別作用，含等體積DMSO的DMEM培養基作為對照組。收集作用48 h后的細胞，PBS洗2次，用4%的多聚甲醛室溫固定20 min，PBS漂洗數次，Hoechst 33258常溫避光染色10 min后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 RT-RCR分析天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族基因的表達

選取對數生長期的U2OS細胞以1×105個/孔的密度種植于6孔板中，待細胞密度長至約70%時，加入含DAPT的新鮮培養液，使其終濃度分別為0、5、10、30 μmol/L，各組重復3次。藥物處理48 h后去除培養液，Trizol提取RNA，以總RNA為模板，行逆轉錄，反應條件為70℃ 5 min，42℃ 1 h，95℃ 10 min。PCR反應條件為94℃ 5 min；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，30～50個循環；72℃延伸5 min。以2-△△Ct值表示目的基因mRNA的相對表達水平。相關引物序列見表1。

1.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達水平

選取對數生長期的U2OS細胞以1×105個/孔的密度種植于6孔板中，待細胞密度長至約70%時，加入含DAPT的新鮮培養液，使其終濃度分別為0、5、10、30 μmol/L，各組重復3次。藥物處理48 h后，去除培養液，收集細胞，PBS清洗離心，加入蛋白裂解液，定量蛋白（BCA法），SDS-PAGE電泳，然后電轉至PVDF膜，將膜封閉于含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉1 h；兔抗人Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體稀釋后（1∶1000）4℃過夜，二抗稀釋后室溫封膜2 h，暗室ECL化學發光，膠片顯影，定影。以GAPDH為內參，評價蛋白相對表達量。

1.8 Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性檢測

采用Caspase活性檢測試劑盒測定Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，分別將0、5、10、20、30 μmol/L DAPT處理過的細胞在冰上用裂解液裂解15 min，13 000 r/min離心30 min，取上清液，然后在96孔板中于每20～40 μg蛋白中加入90 μL相應的探針和10 μL相應的催化酶，37℃下培養2 h，最后通過酶標儀測定樣品的吸光值確定Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性。

1.9 統計學方法

用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DAPT對骨肉瘤U2OS細胞增殖的影響

CCK-8法檢測發現，使用不同濃度的DAPT處理后，在24～72 h時間范圍內U2OS細胞增殖受到明顯抑制，并且抑制作用呈劑量和時間相關依賴性，在濃度為5 μmol/L時即出現抑制細胞增殖的作用，且隨著DAPT劑量的增加和作用時間的延長，其抑制效果也相應增加。各個濃度及作用時間對U2OS細胞活性的影響見圖1。

2.2 DAPT對骨肉瘤U2OS細胞凋亡的影響

通過Annexin V-FITC和PI雙染標記法結合流式細胞儀進行檢測，結果顯示，隨著DAPT濃度的增加，凋亡率也逐漸升高，DAPT 5、10、20 μmol/L濃度組作用48 h后，其凋亡率分別為（10.1±1.8）%、（19.1±1.6）%、（31.3±3.1）%，與對照組（2.1±0.4）%相比，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖2。

2.3 Hoechst 33258染色法觀察細胞形態學改變

熒光顯微鏡下顯示對照組人骨肉瘤U2OS細胞核完整，著色均勻，熒光成彌散狀，相對比較黯淡。DAPT組（5、10、20 μmol/L）處理48 h后，可見染色質凝聚，細胞核出現裂解，著色不規則且不均勻，部分濃染，呈現出細胞凋亡的典型變化即核碎裂，產生凋亡小體的征象。見圖3（封四）。

2.4 DAPT誘導骨肉瘤U2OS細胞凋亡通路相關mRNA表達水平的改變

不同濃度DAPT（0、5、10、30 μmol/L）作用于U2OS細胞48 h后，采用RT-PCR檢測細胞凋亡通路相關mRNA表達水平的改變。結果顯示，DAPT能明顯誘導U2OS細胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達增高，與對照組相比，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。提示U2OS細胞經DAPT處理后發生了凋亡，且凋亡程度與其濃度呈正相關。見圖4。

2.5 DAPT誘導骨肉瘤U2OS細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的改變

為進一步了解DAPT促凋亡的具體機制，本研究通過Western blot檢測了Bax和Bcl-2表達水平的改變。結果顯示，不同濃度DAPT（0、5、10、30 μmol/L）作用于U2OS細胞48 h后，促凋亡蛋白Bax的表達水平隨DAPT濃度增加而逐漸升高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達水平則隨DAPT濃度增加而逐漸下降，與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖5。

2.6 DAPT對骨肉瘤U2OS細胞Caspase依賴的凋亡通路活性的影響

為進一步了解DAPT促進骨肉瘤細胞凋亡的具體機制，本研究探討了其對Caspase凋亡通路的影響。結果顯示，應用不同濃度的DAPT（0、5、10、20、30 μmol/L）作用于U2OS細胞48 h后，與對照組相比，5、10、20、30 μmol/L DAPT均能夠提高Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性，且隨著濃度的增加，其活性也不斷增高，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖6。endprint

3 討論

Notch是一條相對保守的信號通路，其在多種腫瘤中均參與調控，究竟發揮抑癌還是促癌的作用，至今仍無定論。2004年，國外學者Kawakami等[14]首先報道了骨肉瘤患者Notch1高表達，隨后國內外眾多學者通過體外或體內研究紛紛表明Notch信號通路參與了骨肉瘤的增殖、分化、凋亡、耐藥以及對骨肉瘤干細胞的調控，活化Notch信號通路對骨肉瘤起促癌作用等[15-17]。2009年，Tanaka等[18]研究表明，骨肉瘤患者標本中Notch2、Jagged1、HEY1和HEY2的表達增高，而使用γ-分泌酶抑制劑則能有效抑制體外骨肉瘤HOS和143B細胞的生長，同時也能有效抑制裸鼠移植瘤的生長，從而證實了γ-分泌酶抑制劑治療骨肉瘤的有效性，但僅從周期抑制的角度闡述了γ-分泌酶抑制劑的作用機制。

前期研究發現，NICD1在骨肉瘤中高表達，NICD1與骨肉瘤的發生、發展關系密切[19]。γ-分泌酶抑制劑DAPT可以特異性地阻斷Notch信號通路從而抑制骨肉瘤細胞的增殖[20]。本實驗中，通過采用濃度梯度的Notch信號通路抑制劑DAPT體外作用于人骨肉瘤系U2OS，應用CCK-8試驗檢測發現，梯度濃度的DAPT可以有效抑制骨肉瘤細胞的增殖，且細胞存活率與DAPT的作用濃度和時間呈正相關，當DAPT濃度為10 μmol/L，作用時間48 h時其抑制作用明顯增強。與國內學者游浩等[17]研究結果相似，提示DAPT可以體外抑制骨肉瘤細胞的增殖，對骨肉瘤細胞起殺傷作用。

臨床和基礎研究均顯示，凋亡與腫瘤的發生、發展有密切關系，誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤治療有極為重要的意義。Annexin V-FITC和PI雙染標記法結合流式細胞儀是常用的檢測細胞凋亡的重要方法。結果顯示，DAPT在體外誘導人骨肉瘤U2OS細胞發生凋亡，且其凋亡率隨著DAPT濃度的增加而增加。Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，與細胞核結合而發出藍色熒光，常被用來進行凋亡細胞的形態學檢測。通過熒光顯微鏡下觀察顯示5、10、20 μmol/L的DAPT可誘導骨肉瘤細胞發生凋亡，細胞核出現固縮、碎裂，顯現凋亡小體征象。這些結果都說明，Notch抑制劑可以有效誘導骨肉瘤細胞發生凋亡。

在細胞凋亡的執行過程中，Caspase家族起著非常重要的作用，這種凋亡方式被簡稱為Caspase依賴的細胞凋亡途徑。為進一步闡明DAPT誘導骨肉瘤U2OS細胞凋亡機制，通過Western blot檢測了促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達情況，發現隨著DAPT作用濃度的增高，Bax的表達逐漸增加，而Bcl-2的表達則逐漸降低，從而解除了對Caspase的抑制，導致細胞凋亡的發生。在本研究中，應用RT-PCR檢測確實發現Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表達水平隨DAPT濃度增加而不斷升高，其原因可能是Bax/Bcl-2比值升高，解除了對Caspase家族相關蛋白的抑制作用，激活了凋亡級聯反應的發生。采用Caspase活性檢測試劑盒檢測不同濃度DAPT對Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性的影響，結果顯示，U2OS細胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性在加入DAPT處理后均不同程度明顯增高，且隨DAPT濃度的增加，其活性逐漸提高。這些結果均提示DAPT誘導的U2OS細胞凋亡與Caspase級聯活化有關。

綜上所述，Notch通路抑制劑DAPT對骨肉瘤U2OS細胞具有明顯的抑制增殖并誘導細胞凋亡作用，DAPT可能通過Caspase依賴的凋亡途徑對骨肉瘤U2OS細胞產生殺傷作用，其作用機制涉及促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降，從而激活Caspase的凋亡通路，引發細胞凋亡的信號轉導級聯過程，最終導致細胞凋亡的發生。DAPT細胞毒性低，副作用較少，因而有望成為治療骨肉瘤理想的靶向治療藥物，為骨肉瘤的治療提供了新途徑和新思路。

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（收稿日期：2017-05-17 本文編輯：程 銘）endprint