DAPT對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖和凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究

胡國(guó)海　代國(guó)　劉蓋為

[摘要] 目的 觀察γ-分泌酶抑制劑DAPT對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS增殖和凋亡的影響，探討DAPT抑制骨肉瘤增殖并誘導(dǎo)其凋亡的可能機(jī)制。 方法 采用體外培養(yǎng)人成骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，CCK-8法檢測(cè)不同濃度DAPT對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞系U2OS生長(zhǎng)的抑制作用；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Hoechst 33258染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)DAPT對(duì)凋亡通路相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)的影響；采用Caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性變化。 結(jié)果 CCK-8檢測(cè)顯示5～50 μmol/L的DAPT可抑制人骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖并具有時(shí)間和劑量依賴性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示5、10、20 μmol/L的DAPT可明顯誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；5、10、20 μmol/L的DAPT處理后，Hoechst 33258染色可見(jiàn)凋亡小體；RT-PCR和Western blot分析顯示，經(jīng)DAPT（5、10、30 μmol/L）處理后的骨肉瘤細(xì)胞系U2OS表達(dá)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA較對(duì)照組明顯增高（P < 0.05），促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加（P < 0.05），抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少（P < 0.05）；Caspase活性檢測(cè)顯示，DAPT（5、10、20、30 μmol/L）處理后，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性較對(duì)照組明顯升高（P < 0.05）。 結(jié)論 γ-分泌酶抑制劑DAPT對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的增殖有顯著抑制作用，并可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制可能與激活Caspase依賴的凋亡途徑有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] γ-分泌酶抑制劑；DAPT；骨肉瘤；增殖；凋亡

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）10（a）-0004-06

[Abstract] Objective To observe the effect of gamma secretase inhibitor DAPT on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS， and to explore the possible mechanism of DAPT inhibiting osteosarcoma proliferation and inducing apoptosis. Methods Osteosarcoma cell line U2OS was cultured in vitro. Cell proliferation was tested by cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Double stained by Annexin V-FITC and Propidium Iodide （PI）， the cells were detected by flow cytometry （FCM） for apoptosis. Hoechst 33258 was used to detect the morphological change of typical apoptotic cells. The apoptosis related mRNA and protein levels in U2OS were detected by RT-qPCR and Western blot. The activities of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 were measured with Caspase activity assay kit. Results CCK-8 assay showed that 5-50 μmol/L DAPT inhibited the proliferation of human osteosarcoma U2OS cells and in a time- and dose-dependent manners. Flow cytometry showed that 5， 10 and 20 μmol/L DAPT could significantly induce apoptosis of osteosarcoma U2OS cells， compared to the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Apoptotic body could be observed by Hoechst 33258 staining after treatment with 5， 10 and 20 μmol/L DAPT. RT-PCR and Western blot analysis showed that after treatment with DAPT （5， 10， 30 μmol/L）， the expression of Caspase-3， 8 ，9 mRNA were higher than those of control group （P < 0.05）， the pro-apoptotic protein Bax increased （P < 0.05）， and anti-apoptosis protein Bcl-2 protein decreased （P < 0.05）. The activities of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 promoted obviously after treatment with DAPT （5， 10， 20， 30 μmol/L） when compared with the control group （P < 0.05）. Conclusion DAPT can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS. Its mechanism of action may be related to activation of Caspase dependent apoptosis pathway.endprint

[Key words] γ-secretase inhibitor； DAPT； Osteosarcoma； Proliferation； Apoptosis

骨肉瘤是一種臨床上常見(jiàn)的骨原發(fā)惡性腫瘤，起源于間葉組織，占惡性骨腫瘤的20%～45%，以青少年患者居多，易復(fù)發(fā)和早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。自20世紀(jì)70年代開(kāi)始引入新輔助化療的理念，使患者的5年生存率從不足20%提高到65%～70%[1-2]。保肢手術(shù)的開(kāi)展也使患者的生存質(zhì)量得到顯著改善與提高。但是，骨肉瘤局部復(fù)發(fā)率并沒(méi)有因?yàn)樾螺o助化療而降低，始終維持在10%～20%，伴有肺部轉(zhuǎn)移的患者5年生存率亦不足20%[3]。近40年來(lái)，雖然治療方案在不斷的改進(jìn)，但仍然無(wú)法解決腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥的問(wèn)題，這使得骨肉瘤治療處在瓶頸期[2，4]。因而尋找新的或更加有效的治療藥物或治療方式顯得極為緊迫。

研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展中起了極為重要的作用[5-6]。Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中，其突變可導(dǎo)致果蠅殘翅而得名，Notch信號(hào)是通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的，當(dāng)配體與受體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)2次酶切形成NICD（Notch intracellular domain）前體，關(guān)鍵的裂解發(fā)生在第3次酶切位點(diǎn)上，由早老素依賴的γ-分泌酶進(jìn)行，酶切后釋放Notch受體真正的激活形式NICD。隨后，NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，參與基因調(diào)控[7]。γ-分泌酶抑制劑DAPT可有通抑制Notch通路中的關(guān)鍵蛋白γ-分泌酶，從而有效抑制Notch的活化。國(guó)內(nèi)外研究表明，DAPT在體外、體內(nèi)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，如卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌[8-11]。前期研究表明，Notch信號(hào)通路在骨骼的發(fā)育和骨的重塑中都起到重要作用，Notch信號(hào)通路失調(diào)會(huì)導(dǎo)致骨的發(fā)育障礙甚至形成骨肉瘤[12]。還有學(xué)者指出，Notch信號(hào)通路對(duì)促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移也起到關(guān)鍵作用[13]。因此，如若通過(guò)藥物或者其他方式特異性地阻斷Notch信號(hào)通路有可能成為潛在的治療骨肉瘤的靶點(diǎn)。

本研究擬通過(guò)應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號(hào)通路，從而研究DAPT對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡的能力，并進(jìn)一步檢測(cè)了其對(duì)凋亡相關(guān)通路的影響，旨在為進(jìn)一步明確γ-分泌酶抑制劑DAPT的抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（the Cell Bank of Chinese Academy of Sciences，中國(guó)，上海）。DMEM培養(yǎng)基、新鮮小牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；γ-分泌酶抑制劑DAPT購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)），用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10 mmol/L的儲(chǔ)存液分裝備用，使用時(shí)用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，DMSO的含量小于0.1%；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）購(gòu)自同仁化學(xué)研究所（日本）；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基公司（南京）；DMSO、Hoechst 33258及胰蛋白酶均購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）；Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司（上海）；一抗Bax、Bcl-2和GAPDH均購(gòu)自CST（美國(guó)）公司；BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司（上海）；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；垂直電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；TRIzol法總RNA提取試劑盒購(gòu)自Takara（日本）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑購(gòu)于Thermo（美國(guó)）公司；所有引物由上海生工合成（上海）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%小牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、95%空氣以及飽和濕度孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)，每48小時(shí)換液一次，用0.25%含EDTA胰酶消化液消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)DAPT對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h待其貼壁后加入終濃度分別為5、10、20、30、40、50 μmol/L DAPT，陰性對(duì)照組加等體積的DMEM培養(yǎng)液處理（每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔），每個(gè)濃度處理24、48、72 h后，加入CCK-8 10 μL、培養(yǎng)液90 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率=[（As-Ab）]/[（Ac-Ab）]×100%，其中，As為給藥實(shí)驗(yàn)組OD值（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、毒性物質(zhì)），Ac為陰性對(duì)照組OD值（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有毒性物質(zhì)），Ab為空白孔OD值（不含細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8）。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)DAPT對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的影響

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤U2OS細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，按2 mL/孔接種于6孔板，37℃、5%CO2、95%空氣以及飽和濕度孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后吸棄原培養(yǎng)液，加入含有終濃度分別為5、10、20 μmol/L的DAPT新鮮DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（0 μmol/L DAPT）。藥物作用48 h后，各組重復(fù)3次，經(jīng)胰酶消化，收集細(xì)胞于流式管內(nèi)，1500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，用稀釋好的結(jié)合緩沖液（結(jié)合緩沖液∶去離子水按1∶10稀釋）90 μL重懸細(xì)胞。每管依次加Annexin V-FITC 5 μL，再加入5 μL PI（Propidium Iodide）染色液，輕輕混勻，室溫下避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。以Annexin V-FITC為橫坐標(biāo)軸，以PI為縱坐標(biāo)軸，右上象限代表晚期凋亡的細(xì)胞（Annexin V-FITC陽(yáng)性，PI陽(yáng)性），右下象限代表早期凋亡的細(xì)胞（Annexin V-FITC陽(yáng)性，PI陰性），左上象限代表壞死細(xì)胞碎片（Annexin V-FITC陽(yáng)性，PI陽(yáng)性），左下象限代表活細(xì)胞（Annexin V-FITC陰性，PI陰性）。endprint

1.5 Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS細(xì)胞接種于6孔板中，行細(xì)胞玻璃爬片實(shí)驗(yàn)，采用經(jīng)CCK-8和流式檢測(cè)作用較明顯的5、10、20 μmol/L DAPT分別作用，含等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組。收集作用48 h后的細(xì)胞，PBS洗2次，用4%的多聚甲醛室溫固定20 min，PBS漂洗數(shù)次，Hoechst 33258常溫避光染色10 min后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 RT-RCR分析天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族基因的表達(dá)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度種植于6孔板中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至約70%時(shí)，加入含DAPT的新鮮培養(yǎng)液，使其終濃度分別為0、5、10、30 μmol/L，各組重復(fù)3次。藥物處理48 h后去除培養(yǎng)液，Trizol提取RNA，以總RNA為模板，行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為70℃ 5 min，42℃ 1 h，95℃ 10 min。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，30～50個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。以2-△△Ct值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

1.7 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度種植于6孔板中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至約70%時(shí)，加入含DAPT的新鮮培養(yǎng)液，使其終濃度分別為0、5、10、30 μmol/L，各組重復(fù)3次。藥物處理48 h后，去除培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，PBS清洗離心，加入蛋白裂解液，定量蛋白（BCA法），SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜封閉于含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉1 h；兔抗人Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體稀釋后（1∶1000）4℃過(guò)夜，二抗稀釋后室溫封膜2 h，暗室ECL化學(xué)發(fā)光，膠片顯影，定影。以GAPDH為內(nèi)參，評(píng)價(jià)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性檢測(cè)

采用Caspase活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，分別將0、5、10、20、30 μmol/L DAPT處理過(guò)的細(xì)胞在冰上用裂解液裂解15 min，13 000 r/min離心30 min，取上清液，然后在96孔板中于每20～40 μg蛋白中加入90 μL相應(yīng)的探針和10 μL相應(yīng)的催化酶，37℃下培養(yǎng)2 h，最后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的吸光值確定Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAPT對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，使用不同濃度的DAPT處理后，在24～72 h時(shí)間范圍內(nèi)U2OS細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并且抑制作用呈劑量和時(shí)間相關(guān)依賴性，在濃度為5 μmol/L時(shí)即出現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用，且隨著DAPT劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制效果也相應(yīng)增加。各個(gè)濃度及作用時(shí)間對(duì)U2OS細(xì)胞活性的影響見(jiàn)圖1。

2.2 DAPT對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)Annexin V-FITC和PI雙染標(biāo)記法結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著DAPT濃度的增加，凋亡率也逐漸升高，DAPT 5、10、20 μmol/L濃度組作用48 h后，其凋亡率分別為（10.1±1.8）%、（19.1±1.6）%、（31.3±3.1）%，與對(duì)照組（2.1±0.4）%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3 Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

熒光顯微鏡下顯示對(duì)照組人骨肉瘤U2OS細(xì)胞核完整，著色均勻，熒光成彌散狀，相對(duì)比較黯淡。DAPT組（5、10、20 μmol/L）處理48 h后，可見(jiàn)染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核出現(xiàn)裂解，著色不規(guī)則且不均勻，部分濃染，呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型變化即核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體的征象。見(jiàn)圖3（封四）。

2.4 DAPT誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡通路相關(guān)mRNA表達(dá)水平的改變

不同濃度DAPT（0、5、10、30 μmol/L）作用于U2OS細(xì)胞48 h后，采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路相關(guān)mRNA表達(dá)水平的改變。結(jié)果顯示，DAPT能明顯誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達(dá)增高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。提示U2OS細(xì)胞經(jīng)DAPT處理后發(fā)生了凋亡，且凋亡程度與其濃度呈正相關(guān)。見(jiàn)圖4。

2.5 DAPT誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變

為進(jìn)一步了解DAPT促凋亡的具體機(jī)制，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)了Bax和Bcl-2表達(dá)水平的改變。結(jié)果顯示，不同濃度DAPT（0、5、10、30 μmol/L）作用于U2OS細(xì)胞48 h后，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平隨DAPT濃度增加而逐漸升高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平則隨DAPT濃度增加而逐漸下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖5。

2.6 DAPT對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞Caspase依賴的凋亡通路活性的影響

為進(jìn)一步了解DAPT促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本研究探討了其對(duì)Caspase凋亡通路的影響。結(jié)果顯示，應(yīng)用不同濃度的DAPT（0、5、10、20、30 μmol/L）作用于U2OS細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，5、10、20、30 μmol/L DAPT均能夠提高Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性，且隨著濃度的增加，其活性也不斷增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖6。endprint

3 討論

Notch是一條相對(duì)保守的信號(hào)通路，其在多種腫瘤中均參與調(diào)控，究竟發(fā)揮抑癌還是促癌的作用，至今仍無(wú)定論。2004年，國(guó)外學(xué)者Kawakami等[14]首先報(bào)道了骨肉瘤患者Notch1高表達(dá)，隨后國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者通過(guò)體外或體內(nèi)研究紛紛表明Notch信號(hào)通路參與了骨肉瘤的增殖、分化、凋亡、耐藥以及對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的調(diào)控，活化Notch信號(hào)通路對(duì)骨肉瘤起促癌作用等[15-17]。2009年，Tanaka等[18]研究表明，骨肉瘤患者標(biāo)本中Notch2、Jagged1、HEY1和HEY2的表達(dá)增高，而使用γ-分泌酶抑制劑則能有效抑制體外骨肉瘤HOS和143B細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也能有效抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，從而證實(shí)了γ-分泌酶抑制劑治療骨肉瘤的有效性，但僅從周期抑制的角度闡述了γ-分泌酶抑制劑的作用機(jī)制。

前期研究發(fā)現(xiàn)，NICD1在骨肉瘤中高表達(dá)，NICD1與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[19]。γ-分泌酶抑制劑DAPT可以特異性地阻斷Notch信號(hào)通路從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖[20]。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)采用濃度梯度的Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT體外作用于人骨肉瘤系U2OS，應(yīng)用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，梯度濃度的DAPT可以有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且細(xì)胞存活率與DAPT的作用濃度和時(shí)間呈正相關(guān)，當(dāng)DAPT濃度為10 μmol/L，作用時(shí)間48 h時(shí)其抑制作用明顯增強(qiáng)。與國(guó)內(nèi)學(xué)者游浩等[17]研究結(jié)果相似，提示DAPT可以體外抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)骨肉瘤細(xì)胞起殺傷作用。

臨床和基礎(chǔ)研究均顯示，凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤治療有極為重要的意義。Annexin V-FITC和PI雙染標(biāo)記法結(jié)合流式細(xì)胞儀是常用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要方法。結(jié)果顯示，DAPT在體外誘導(dǎo)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡，且其凋亡率隨著DAPT濃度的增加而增加。Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，與細(xì)胞核結(jié)合而發(fā)出藍(lán)色熒光，常被用來(lái)進(jìn)行凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測(cè)。通過(guò)熒光顯微鏡下觀察顯示5、10、20 μmol/L的DAPT可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎裂，顯現(xiàn)凋亡小體征象。這些結(jié)果都說(shuō)明，Notch抑制劑可以有效誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過(guò)程中，Caspase家族起著非常重要的作用，這種凋亡方式被簡(jiǎn)稱為Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑。為進(jìn)一步闡明DAPT誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡機(jī)制，通過(guò)Western blot檢測(cè)了促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著DAPT作用濃度的增高，Bax的表達(dá)逐漸增加，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)則逐漸降低，從而解除了對(duì)Caspase的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在本研究中，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)確實(shí)發(fā)現(xiàn)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表達(dá)水平隨DAPT濃度增加而不斷升高，其原因可能是Bax/Bcl-2比值升高，解除了對(duì)Caspase家族相關(guān)蛋白的抑制作用，激活了凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。采用Caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度DAPT對(duì)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性的影響，結(jié)果顯示，U2OS細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性在加入DAPT處理后均不同程度明顯增高，且隨DAPT濃度的增加，其活性逐漸提高。這些結(jié)果均提示DAPT誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞凋亡與Caspase級(jí)聯(lián)活化有關(guān)。

綜上所述，Notch通路抑制劑DAPT對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞具有明顯的抑制增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，DAPT可能通過(guò)Caspase依賴的凋亡途徑對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，其作用機(jī)制涉及促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，從而激活Caspase的凋亡通路，引發(fā)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)過(guò)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。DAPT細(xì)胞毒性低，副作用較少，因而有望成為治療骨肉瘤理想的靶向治療藥物，為骨肉瘤的治療提供了新途徑和新思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Allison DC，Carney SC，Ahlmann ER，et al. A Meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era [J]. Sarcoma，2012，2012：704872.

[2] 郭征.我國(guó)骨肉瘤治療的現(xiàn)狀與問(wèn)題及發(fā)展方向[J].中國(guó)骨與關(guān)節(jié)雜志，2015，4（5）：338-342.

[3] Vijayamurugan N，Bakhshi S. Review of management issues in relapsed osteosarcoma [J]. Exp Rev Anticancer Ther，2014，14（2）：151-161.

[4] Luetke A，Meyers PA，Lewis I，et al. Osteosarcoma treatment-where do we stand a state of the art review [J]. Cancer Tre？鄄atment Rev，2014，40（4）：523-532.

[5] Tao J，Jiang M，Jiang L，et al. Notch activation as a driver of osteogenic sarcoma [J]. Cancer Cell，2014，26（3）：390-401.

[6] 趙海恩，趙新文.骨肉瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)矯形外科雜志，2014，22（5）：434-440.

[7] Mcmanus MM，Weiss KR，Hughes DPM. Understanding the role of Notch in osteosarcoma [M]// Current advances in oste？鄄osarcoma. Springer International Publishing，2014：67-92.endprint

[8] 盧余莉，謝程.γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，45（4）：578-581.

[9] 魏敏，陸曉媛，繆璐.γ-分泌酶抑制劑DAPT對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞體外增殖的影響[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（5）：390-392.

[10] 胡敏，李少林，袁犁，等.γ分泌酶抑制劑阻斷Notch1信號(hào)通路對(duì)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞化療敏感性的影響[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2012，25（1）：23-28.

[11] 周敏，范志文，韓瑞超.γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549增殖的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，32（8）：1024-1028.

[12] Zanotti S，Canalis E. Notch and the Skeleton [J]. Mol Cell Biol，2010，30（4）：886-896.

[13] Hughes DP. How the NOTCH pathway contributes to the ability of osteosarcoma cells to metastasize [J]. Cancer Treat Res，2009，152：479-496.

[14] Kawakami T，Siar CH，Ng KH，et al. Expression of Notch in a case of osteosarcoma of the maxilla [J]. Eur J Med Res，2004，9（11）：533-535.

[15] Yu L，F(xiàn)an Z，F(xiàn)ang S，et al. Cisplatin selects for stem-like cells in osteosarcoma by activating Notch signaling [J]. Oncotarget，2016，7（22）：33055-33068.

[16] Engin F，Bertin T，Ma O，et al. Notch signaling contributes to the pathogenesis of human osteosarcomas [J]. Human Mol Genet，2009，18（8）：1464-1470.

[17] 游浩，張覓，劉洋，等.阻斷Notch信號(hào)通路抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，43（5）：541-545.

[18] Tanaka M，Setoguchi T，Hirotsu M，et al. Inhibition of Notch pathway prevents osteosarcoma growth by cell cycle regulation [J]. Br J Cancer，2009，100（12）：1957-1965.

[19] 許自力，鄧展生，許宇霞.Notch1、Dll4蛋白在骨肉瘤的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)骨腫瘤骨病，2009，8（1）：28-31.

[20] Li R，Zhang W，Cui J，et al. Targeting BMP9-promoted human osteosarcoma growth by inactivation of notch signaling [J]. Curr Cancer Drug Targets，2014，14（3）：274-285.

（收稿日期：2017-05-17 本文編輯：程 銘）endprint