131例強直性脊柱炎患者Treg細胞與淋巴細胞亞群分析

魏云玉　韓志君　黃紅宇

[摘要] 目的 觀察強直性脊柱炎（AS）患者外周血Treg細胞與淋巴細胞各亞群的變化及HLA-B27的表達，探討各自在AS患者發展中的作用。 方法 應用流式細胞學方法，選取2013年2月～2016年12月于無錫市第二人民醫院骨科和風濕科就診的AS患者131例為AS組，選取健康體檢者127例為正常對照組，進行外周血Treg細胞、淋巴細胞亞群、HLA-B27的檢測，分析Treg細胞、淋巴細胞亞群、HLA-B27與AS患者的關系。 結果 131例AS組中HLA-B27檢測陽性為123例（93.89%），正常對照組中HLA-B27檢測陽性為2例（1.57%），差異有統計學意義（P < 0.05）。AS組患者CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD19+陽性率明顯高于正常對照組（P < 0.05），CD3+CD8+、CD16+/CD56+陽性率低于正常對照組（P < 0.05）。AS組患者CD4+CD25high、CD4+CD25highCD127low陽性率均低于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組CD3+、CD3+CD4+陽性率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 HLA-B27與AS有強相關性。外周血中淋巴細胞各亞群組分在AS與正常對照組中存在明顯差異。同時外周血中Treg細胞在AS患者中明顯降低。以上發現提示細胞免疫和體液免疫可能在AS中發揮重要作用。

[關鍵詞] 強直性脊柱炎；Treg細胞；淋巴細胞亞群；HLA-B27

[中圖分類號] R681.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0046-03

[Abstract] Objective To analyze the changes of regulatory T cells （Treg cells） and the subsets of lymphocytes as well as the HLA-B27 expression in peripheral blood of ankylosing spondylitis （AS） patients， and then explore their roles in the development of AS. Methods Flow cytometry was applied. From February 2013 to December 2016， Department of Orthopedic and Rheumatology in Wuxi Second People's Hospital， 131 cases of AS patients were selected as AS group， 127 healthy subjects were selected as normal control group. The peripheral blood Treg cells， lymphocyte subsets and HLA-B27 were detected. The relationship of Treg cells， lymphocyte subsets， HLA-B27 and AS patients were analyzed. Results 131 cases of AS group， HLA-B27 positive for 123 cases （93.89%）， the positive rate of HLA-B27 in normal control group was 2 cases （1.57%）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive rate of CD3+CD4+， CD4/CD8 and CD3-CD19+ in AS group were significantly higher than those in normal control group （P < 0.05）. The positive rate of CD3+CD8+， CD16+/CD56+ in AS group were lower than those in normal control group （P < 0.05）. The positive rate of CD4+CD25high and CD4+CD25highCD127low in AS group were lower than those in normal control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in the positive rate of CD3+ and CD3+CD4+ between two groups （P > 0.05）. Conclusion HLA-B27 has a strong correlation with AS. There are significant differences in the subgroups of lymphocytes in peripheral blood between AS and normal control group. At the same time， peripheral blood Treg cells in AS patients are significantly reduced. The above findings suggest that cellular immunity and humoral immunity may play an important role in AS.endprint

[Key words] Ankylosing spondylitis； Regulatory T cells； Lymphocyte subsets； HLA-B27

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種全身免疫疾病，以慢性炎癥為主，它可侵犯脊柱關節，累及肌腱、滑膜等關節，大部分患者有骶髂關節炎。AS青壯年多發，有家族聚集性，可能與遺傳相關。其發病機制復雜，迄今未明[1]。Treg細胞是有免疫調節作用的特殊的一群淋巴細胞。在維持免疫自穩中起重要作用。AS患者是一種全身性免疫疾病，本研究主要觀察其與外周血淋巴細胞和Treg細胞比例變化的關系，探討淋巴細胞及其各組分失衡對AS發生、發展的影響，有可能為AS的發病機制研究及治療提供一條思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年2月～2016年12月于無錫市第二人民醫院骨科和風濕科門診或住院的AS患者131例為AS組，患者診斷均符合1984年的AS紐約標準[2]，其中男75例，女56例，年齡18～65歲，平均（27±8）歲，病程3～8年，平均（5.3±2.7）年，收集了AS患者基本情況和臨床資料，HLA-B27陽性患者128例，陰性患者3例。患者活動度評價，采用2009年由國際脊柱關節炎協會（ASAS）重新制訂的新的AS病情活動度評分（ASDAS）[3]。正常對照組選取健康體檢者127例，男70例，女57例，平均年齡（26±9）歲。均不符合1984年的AS診斷標準，無重大疾病史，沒有長期應用激素或免疫抑制劑，咨詢受檢者，本人或直系親屬未患自身免疫性疾病。

1.2 主要儀器和試劑

CYTOMICS FC500流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），熒光抗體CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，Anti-HLA-B27-FITC/Anti-HLA-B7-PE，CD4-FITC，CD25-PECY5，CD127-PE，購于Beckman Coulter公司，CD3-FITC/CD16+56-PE，CD19-PE，購于美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 血液樣本準備 所有AS患者和正常對照組人員于早晨7：30～8：30之間空腹抽取2 mL靜脈于EDTA抗凝管中。2 h內用于流式細胞儀的分析。

1.3.2 流式細胞分析HLA-B27、淋巴細胞亞群、Treg細胞 將每個標本分成5管：HLA-B27/HLA-B7管、CD4/CD8/CD3管、CD4/CD25/CD127管、CD3/CD16+56管和CD19管。分別加入各自抗體20 μL，每管加入100 μL EDTA抗凝全血，避光孵育20 min，PBS洗滌2次后上機檢測。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HLA-B27檢測

131例AS組中HLA-B27檢測陽性為123例（93.89%），正常對照組中HLA-B27檢測陽性為2例（1.57%），差異有統計學意義（P < 0.05）。我國AS患者中HLA-B27陽性率達90%[4]。

2.2 淋巴細胞亞群檢測

AS組患者CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD19+陽性率明顯高于正常對照組（P < 0.05），CD3+CD8+、CD16+/CD56+陽性率低于正常對照組（P < 0.05）；兩組CD3+陽性率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 Treg細胞檢測

AS組患者CD4+CD25high、CD4+CD25highCD127low陽性率均低于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；兩組CD3+CD4+陽性率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

AS是具有遺傳性的慢性自身免疫疾病，可伴有血液系統、肺部、心臟、神經系統等關節外病變損害[5]。其發病率在我國約為0.3%[6-7]。HLA-B27與AS有強相關性，其直接參與了AS的發病。本研究結果AS患者HLA-B27陽性率達到93.89%，正常人也有一部分陽性，但比例比較小。HLA-B27高表達的同時，可能其他免疫分子也發生了變化，一般的表現為免疫功能非正常的亢進，形成多關節的炎性反應[8]。

在AS的發生、發展過程中還與很多因素有關，免疫功能的紊亂、炎癥細胞浸潤、遺傳因素、環境因素、細胞因子的作用等都有可能對其發揮作用[9-12]。淋巴細胞亞群和Treg細胞數量的變化和功能上的失衡與多種免疫疾病有關[13-14]。我們的研究發現，AS患者的淋巴細胞有多項亞群以及Treg細胞與正常對照差異有顯著性。表明AS患者體內存在免疫功能的失衡。Treg細胞在數量或功能上的減少導致免疫穩定的破壞，使AS患者發病。這可能是一個重要原因。

本文的數據顯示，CD3+CD4+T細胞升高，CD3+CD8+T細胞降低，CD4/CD8比值升高，CD3-CD19+B細胞升高，提示AS患者細胞免疫功能亢進，體液免疫可能也增強了，CD16+/CD56+NK細胞功能下降。有研究表明[15-16]，AS患者的B淋巴細胞活動性增強，增加的B淋巴細胞分泌大量的免疫球蛋白，使血清中免疫球蛋白顯著增加，自身抗體也增多[17-21]，臨床上出現一系列的免疫功能紊亂的癥狀。NK細胞功能下降使抑制B細胞的分化增殖功能下降，體液免疫功能進一步增強，疾病加重。Park等[22]研究表明，系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫病患者外周血NK細胞減少、功能受損。本文研究發現，AS患者NK細胞也下降，不能有效調節自身免疫。另外，Treg細胞也可以反向調節T淋巴細胞的活性與抑制其增殖，Treg細胞通過直接接觸、釋放細胞因子、顆粒酶等殺傷T細胞、單核細胞、B細胞。endprint

基于以上討論，免疫功能的紊亂在AS的發病過程中起一定的作用，淋巴細胞亞群、Treg細胞的檢測可作為AS的重要診斷指標。適當提高Treg細胞水平和降低B細胞活性，可能對AS患者的治療有重要的意義，這給臨床對AS的治療提供了新的思路。

[參考文獻]

[1] Dicarlo EF，Kahn LB. Inflammatory diseases of the bones and joints [J]. Semin Diagn Pathol，2011，28（1）：53-64.

[2] Van Der Linden S，Valkenburg HA，Cats A. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis. A proposal for modification of the New York criteria [J]. Arthritis Rheum，1984，27（4）：361-368.

[3] Lukas C，Landewe R，Sieper J，et al. Development of an ASAS-en-dorsed activity score（ASDAS）in patients with ankylosing spondylitis [J]. Ann Rheum Dis，2009，68：18-24.

[4] 朱笑夏，陶慶文，金玥，等.HLA-B27陽性與陰性強直性脊柱炎患者骨密度的對比分析[J].中國骨質疏松雜志，2016，22（10）：1230-1236.

[5] 陳鵬凱，閻小萍.126例強直性脊柱炎患者關節外表現分析[J].世界中西醫結合雜志，2014，9（7）：744-745，792.

[6] Liu Y，Li J，Chen B，et al. Familial aggregation ankylosing spondylitis in Southern China [J]. J Rheumatol，2001，28（3）：550-554.

[7] 孫翠華，孟凡杰，王玉芳，等.強直性脊柱炎與HLA-B27相關性的研究進展[J].醫學綜述，2007，13（4）：281-283.

[8] 宋紅林，孟保福，李艷霞，等.強直性脊柱炎患者外周血淋巴細胞及血清PD-1、HLA-B27水平變化[J].山東醫藥，2016，56（16）：55-57.

[9] Benedek TG. How did ankylosing spondylitis become a separate disease？ [J]. Clin Exp Rheumatol，2009，27（4）：S3-S9.

[10] 任明亮，劉鵠，王瀟娉，等.強直性脊柱炎骨髓間充質干細胞誘導Th17/Treg失衡[J].脊柱外科雜志，2016，14（5）：281-285.

[11] Mahmoudi M，Aslani S，Nicknam MH，et al. New insights toward the pathogenesis of ankylosing spondylitis；genetic variations and epigenetic modifications [J]. Mod Rheumatol，2016，18：1-12.

[12] Braun J，Sieper J. Ankylosing spondylitis [J]. Lancet，2007， 369（9570）：1379-1390.

[13] Nistala K，Wedder burn LR. Th17 and regulatory T cells：rebalancing pro-and anti-inflammatory forces in autoimmune arthritis [J]. Rheumatology（Oxford），2009，48（5）：602-606.

[14] 龐莉萍，王莉莎，索塔林，等.依那西普治療升高強直性脊柱炎外周血DC細胞數量[J].中國免疫學雜志，2009， 25：446-449.

[15] 韓義香，章圣輝，吳建玻.B7/CD28在強直性脊柱炎患者外周血淋巴細胞中的表達及意義[J].溫州醫學院學報，2006，36（4）：356-358.

[16] 劉磊，劉健，萬磊，等.強直性脊柱炎患者血小板參數和外周血B、T淋巴細胞衰減因子及調節性T細胞變化[J].中國臨床保健雜志，2016，19（1）：8-11.

[17] Lin Q，Gu JR，Li TW，et al. Value of the peripheral blood B-cells subsets in patients with ankylosing spondylitis [J]. Chin Med J，2009，122（15）：1784-1789.

[18] Wright C，Sibani S，Trudgian D，et al. Detection of multiple autoantibodies in patients with ankylosing spondylitis using nucleic acid programmable protein arrays [J]. Mol Cell Proteomics，2012，11（2）：M9.00384.

[19] 龍思琪，馬莉，李虹，等.強直性脊柱炎患者外周血中循環濾泡輔助性T細胞與抗體分泌B細胞關系的研究[J].中華風濕病學雜志，2016，20（3）：164-168.

[20] 陶江濤，肜祎.督灸治療強直性脊柱炎的臨床效果[J].中國當代醫藥，2016，23（13）：157-159，163.

[21] 薛曉燕，李軍霞，李小峰.強直性脊柱炎患者心臟受累危險因素研究[J].中國當代醫藥，2016，23（12）：22-25.

[22] Park YW，Kee SJ，Cho YN，et al. Impaired differentiation and cytotoxicity of natural killer cells in systemic lupus erythematosus [J]. Arthritis Rheum，2009，60（6）：1753-1763.

（收稿日期：2017-06-06 本文編輯：李亞聰）endprint