丁苯酞對血管性癡呆大鼠記憶能力及海馬CA1區Caspase—3表達的影響

毛西京　朱博馳　于挺敏

[摘要] 目的 觀察丁苯酞對血管性癡呆大鼠記憶能力及海馬CA1區凋亡基因Caspase-3表達的影響，探討丁苯酞對血管性癡呆的保護作用。方法 將80只SPF級健康Wistar大鼠按隨機區組法分為4個組，每組20只：血管性癡呆模型組（VD組）、血管性癡呆模型+丁苯酞氯化鈉注射液組（NBP治療組）、假手術+丁苯酞氯化鈉注射液組（NBP對照組）、假手術組（Sham組），每組再分為4個亞組：術后1、2、4、8周，每個亞組5只。永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型。NBP對照組和NBP治療組大鼠術后1 d開始給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg/（kg·d），Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射（0.2 mL/d）。各組大鼠連續腹腔注射給藥7 d。術后8周亞組大鼠，在術前、術后4周和術后8周進行記憶能力測試（Morris水迷宮）。術后各時間點（1、2、4、8周），留取海馬組織，采用免疫組化法觀察各組大鼠海馬CA1區Caspase-3的表達。 結果 NBP治療組大鼠逃避潛伏期較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05）。VD組和NBP治療組大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白表達灰度明顯高于Sham組（P < 0.05）；術后4周和8周時，NBP治療組大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白表達均明顯低于VD組大鼠相應時間點（P < 0.05）。VD大鼠術后8周時海馬CA1區Caspase-3表達灰度明顯高于術后1周時（P < 0.05）。 結論 NBP對VD大鼠記憶能力有明顯改善作用，考慮與其抑制VD大鼠海馬CA1區Caspase-3過度表達有關。

[關鍵詞] 丁苯酞；血管性癡呆；海馬；細胞凋亡

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0009-04

[Abstract] Objective To study the effects of 3-n-butylphthalide （NBP） on memory and Caspase-3 expression in the hippocampal CA1 region of vascular dementia rats， in order to explore protective effects and mechanisms of NBP on rats with vascular dementia （VD）. Methods A total of 80 SPF Wistar rats were divided into vascular dementia models group （VD group）， vascular dementia models + NBP injection group （NBP treatment group）， sham surgery + NBP injection group （NBP control group）， sham surgery group （Sham group）， according to random group method. Then each group was divided into four subgroups （n = 5）： 1， 2， 4， and 8 weeks after surgery. VD models were established by ligating bilateral common carotid artery. Then the rats in the NBP treatment group and NBP control group were intraperitoneally injected with NBP 5 mg/（kg·d） for 7 consecutive days. The rats in the VD group and Sham group were intraperitoneally injected with saline （0.2 mL/d） for 7 consecutive days. Memory ability of 8 weeks subgroup rats were tested by Morris water maze at 4 and 8 weeks after surgery. At 1， 2， 4， and 8 weeks after surgery， the rats in each group were decapitated. The brains were obtained， and then hippocampus were isolated. Caspase-3 expression in the hippocampal CA1 region were determined by immunohistochemistry. Results Compared with VD group， escape latency in the NBP treatment group were significantly shorter （P < 0.05）. At 1， 2， 4 and 8 weeks after surgery， Caspase-3 expression in the VD group and NBP treatment group were significantly increased than those in the Sham group （P < 0.05）. Compared with VD group， Caspase-3 expression in the NBP treatment group were significantly lower at 4 and 8 weeks after surgery （P < 0.05）. In VD group， Caspase-3 expression at 8 weeks after surgery was significantly higher than at 1 weeks （P < 0.05）. Conclusion NBP can improve the memory ability of VD rats， which may be connected with the overexpression of caspase-3 in the hippocampus CA1 region of VD rats.endprint

[Key words] 3-n-butylphthalide； Vascular dementia； Hippocampus； Cell apoptosis

丁苯酞（3-n-butylphthalide，NBP）是治療急性期腦梗死的國家級一類新藥[1]。臨床和基礎研究均發現NBP對血管性癡呆（vascular dementia，VD）具有良好的治療和干預效果[2-5]，但其作用機制還缺乏深入的研究。VD發生的最常見病因是腦血管病后的長期慢性腦缺血，細胞凋亡則是最重要的病理機制[6-7]。天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinases，Caspases）是細胞凋亡的具體介導者和執行者[8]，其中Caspase-3則是細胞凋亡的關鍵因子和凋亡信號傳遞的共同通路[9-10]。本研究在制備VD大鼠模型的基礎上，觀察NBP對VD大鼠記憶能力的改善作用，同時檢測大鼠海馬CA1區Caspase-3的表達變化，探討NBP對VD大鼠的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器

SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重（210+10）g，購于吉林大學動物中心，動物合格證號：SCXK（吉）2003-001。丁苯酞氯化鈉注射液（生產廠家：石藥集團恩必普藥業有限公司）。大鼠抗激活型Caspase-3多克隆抗體購自北京博奧森生物公司。Morris水迷宮XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 實驗動物分組

實驗大鼠按隨機區組法分為4個組，每組20只：血管性癡呆模型組（VD組）、血管性癡呆模型+丁苯酞注射劑組（NBP治療組）、假手術+丁苯酞注射劑組（NBP對照組）、假手術組（Sham組）。每組又分為4個亞組：術后1、2、4、8周，每個亞組5只。

1.3 VD大鼠模型制備

采用永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型。術前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，頸前正中做一個長約1 cm的縱形切口，逐層分離各層組織結構，分離出頸總動脈，以1號絲線永久結扎頸總動脈，同法結扎另一側頸總動脈。Sham組和NBP對照組大鼠操作與VD組和NBP治療組大鼠一致，但不結扎雙側頸總動脈。

1.4 藥物干預

NBP對照組和NBP治療組大鼠清醒后，腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液，劑量為5 mg/（kg·d），Sham組和VD組大鼠腹腔注射生理鹽水（0.2 mL/d）。連續給藥7 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠記憶能力測試 用Morris水迷宮進行大鼠記憶能力的檢測（各組術后8周亞組的大鼠，在術前、術后4周和術后8周進行測試）。Morris水迷宮是一個高50 cm、直徑120 cm的圓柱水池，將水迷宮劃分四個象限，將一個高30 cm、直徑12 cm的透明圓柱型有機玻璃平臺置于其中一個象限中心，整個實驗期間平臺位置和水迷宮內外參照物都要保持不變。池壁四個象限各選擇一個入水點，相鄰兩個入水點間距基本均等，向池內注入自來水，加入奶粉使池水混濁不清，水面高出平臺2～3 cm，水溫在25℃左右。第一次實驗預先訓練大鼠，使其在水迷宮中自由游動2 min，并在平臺上站立20 s，適應環境。測試時將大鼠分別從水迷宮的4個入水點放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間，即逃避潛伏期，將其作為大鼠記憶能力的指標，如果大鼠在1 min沒未找到平臺則由實驗者引導其找到平臺，逃避潛伏期記為1 min。

1.5.2 標本采集及免疫組化 術后1、2、4、8周，各組大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟灌流5 min，取腦，分離海馬，10%中性福爾馬林液固定48 h，PBS洗脫3次，80%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片。免疫組化采用SP法操作（Caspase-3多克隆抗體稀釋度為1∶100）。每張組織切片隨機選取5個視野（400倍鏡下），測定陽性表達灰度值，并計算每個視野下的陽性細胞總數所占細胞總數的比率，細胞表達平均灰度=視野灰度×陽性細胞比率，以5個視野的平均值表示。

1.6統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠記憶能力測試結果

同組內比較，NBP治療組和VD組大鼠術后4周和8周逃避潛伏期明顯長于術前（P < 0.05），術后4周和8周逃避潛伏期差異無統計學意義（P > 0.05）；NBP對照組和Sham組各時間點逃避潛伏期差異無統計學意義（P > 0.05）。組間比較，術前各組逃避潛伏期差異無統計學意義（P > 0.05）；術后4周和8周，VD組大鼠和NBP治療組大鼠逃避潛伏期明顯長于Sham組（P < 0.05），NBP治療組大鼠逃避潛伏期較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05）。見表1。

2.2 Caspase-3蛋白在各組大鼠海馬CA1區的表達特征

Caspase-3蛋白陽性表達顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細胞漿。VD組大鼠海馬CA1區神經元數目較少，排列紊亂，部分細胞出現空泡樣變性，Caspase-3表達呈強陽性，NBP治療組大鼠海馬CA1區神經元損傷明顯減小，Caspase-3表達顯著減弱。見圖1（封四）。

2.3 各組大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白的表達情況

VD組和NBP治療組大鼠術后1、2、4周和8周時海馬CA1區Caspase-3蛋白表達灰度明顯高于同期Sham組（P < 0.05）；NBP治療組大鼠4周和8周時海馬CA1區Caspase-3蛋白表達均明顯低于同期VD組大鼠（P < 0.05）。同組內比較，VD組大鼠術后8周大鼠海馬CA1區Caspase-3表達灰度明顯高于術后1周（P < 0.05）。見表2。endprint

3 討論

永久性雙側頸總動脈結扎法符合VD發病病理基礎，與人類VD的發生具有最大程度的相似性[11-12]，因此本研究VD大鼠模型采用此法制備。免疫組化結果顯示：VD組大鼠海馬CA1區神經細胞數目較少，排列紊亂，部分細胞出現空泡樣變性；而NBP治療組大鼠損傷明顯減輕。Morris水迷宮可以檢測實驗大鼠記住周圍環境中幫助其定位水下平臺線索的能力[13]。本研究結果顯示：VD組和NBP治療組術后4周和術后8周水迷宮逃避潛伏期明顯長于術前（P < 0.05），說明VD模型大鼠記憶力受損，造模成功。術后4周，NBP治療組大鼠逃避潛伏期較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05）；術后8周，NBP治療組大鼠逃避潛伏期也較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05），說明NBP對VD大鼠的空間記憶和空間定位能力具有改善作用。

Caspases是細胞凋亡的具體介導者和執行者[8]。Caspase-3是細胞凋亡的關鍵因子和凋亡信號傳遞的共同通路，它的表達情況不僅可以反映細胞凋亡的水平，同時還可以提示凋亡因素的存在[14-18]。本實驗發現：VD組大鼠1、2、4周和8周時海馬CA1區Caspase-3蛋白表達均明顯升高，且隨著時間呈逐漸增強的趨勢，8周時VD組大鼠海馬CA1區Caspase-3表達最強。Caspase-3蛋白的過度表達可以引起大鼠海馬CA1區神經元凋亡的發生。NBP治療組大鼠在4周和8周時海馬CA1區Caspase-3表達較VD組明顯下降（P < 0.05），說明NBP可以抑制VD組大鼠海馬CA1區Caspase-3的過度表達。

本實驗在制備VD大鼠的基礎上，應用NBP給予干預治療，可以改善VD大鼠記憶能力。觀察不同時間點大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白的表達情況，結果發現：VD組大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白表達均明顯升高，且隨著時間呈逐漸增強的趨勢，8周時VD組大鼠海馬CA1區Caspase-3表達最強，證實細胞凋亡的關鍵因素Caspase-3蛋白參與VD的發病過程。NBP干預治療后，VD大鼠在4周和8周時海馬CA1區Caspase-3表達明顯下降，提示NBP可以抑制VD大鼠海馬CA1區Caspase-3的過度表達，從而減弱腦缺血造成的遲發性神經細胞凋亡，起到神經保護作用。

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（收稿日期：2017-06-22 本文編輯：李岳澤）endprint