超高效液相色譜—同位素稀釋串聯質譜法測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留

楊惠宇+張惠峰

摘 要：建立了采用Oasia PRiME HLB固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-同位素稀釋串聯質譜法（UPLC-MS/MS）快速測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留的方法。樣品加入同位素內標，超聲衍生化后用乙酸乙酯超聲提取，經Oasia PRiME HLB固相萃取柱一次性凈化后上機檢測，電噴霧-正離子多反應監測模式，內標法定量。該方法將測試時間縮短至4小時。結果顯示，4種硝基呋喃類代謝物的檢測限為0.01 μg/kg，定量限為0.03 μg/kg，在0.05～10 ng/mL質量濃度范圍內線性良好，4種硝基呋喃類代謝物相關系數r均大于0.999，5個添加濃度水平的平均回收率為88.5%～115.2%，相對標準偏差均小于8，說明該方法快速、準確并且重復性好。

關鍵詞：硝基呋喃類代謝物；高效液相色譜-串聯質譜；水產品；超聲衍生化

近年來，藥物殘留已成為影響中國水產品質量安全的重要因素，而硝基呋喃類藥物因其價格便宜、抗菌效果好等特點，被廣泛應用于水產養殖中[1-2]，同樣也是檢出率最高的違禁藥物之一[3-4]，因此，為確保水產品質量安全和漁業經濟的可持續發展，建立準確可靠、靈敏度高的硝基呋喃類藥物及其代謝物的定量定性方法具有深遠意義。由于硝基呋喃類藥物在動物體內可迅速代謝，通過測定母體化合物的含量是不合適的，因此在水產品質量監測中主要檢測硝基呋喃類代謝物[5]。目前國內外文獻報道測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的檢測方法除質譜分析法還有免疫分析法、光譜分析等[6-7]。硝基呋喃類代謝物一般經衍生化后，采用液液萃取、固相萃取、凝膠滲透色譜、免疫親和色譜、超臨界流體萃取、分子印跡、平行蒸發等方法提取凈化后，用液相色譜法或質譜聯用法進行檢測[8-10]。此外，還有一些新興的方法應用于水產品中硝基呋喃類代謝物的檢測，如原子吸收法[11]、流動注射-化學發光分析技術（FI-CL）[12]、液相色譜電化學檢測器（LC-ECD）[13]，太赫茲時域光譜（THz-TDS）[14]等，但是使用最為普遍的是液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法[15-18]。筆者首次在樣品前處理過程中采用超聲衍生化結合Oasia PRiME HLB固相萃取凈化的方法，并利用超高效液相色譜-同位素稀釋串聯質譜法同時快速測定水產品中4種硝基呋喃類代謝物殘留量。檢測過程僅需4 h，為水產品中硝基呋喃代謝物的檢測提供快速、準確的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

超高效液相色譜-串聯質譜Xevo TQS（UPLC-MS/MS）：美國WATERS公司；BSD-250型震蕩培養箱：上海博訊實業有限公司；TDL-40B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；TTL-DCI型氮吹儀：北京同泰聯科技發展有限公司；TE212-L電子天平：德國Sartorius公司；Research plus移液器：德國Eppendorf公司； KQ-800KDE型高功率數控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；漩渦振蕩器：德國IKA公司，Oasia PRiME HLB固相萃取柱，（WATERS公司）；實驗用水均為超純水。

1.2 試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、甲酸、乙酸銨、正己烷：Fisher Chemicals公司；鹽酸：北京化工廠；2-硝基苯甲醛（2-NBA 衍生化試劑）：ACROS公司；磷酸氫二鉀和二甲亞砜均為國產分析純試劑。

1.3 標準溶液的配制

呋喃唑酮代謝物 3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidone AOZ，純度99.3±0.3%，Dr Ehrenstorfer公司）、呋喃西林代謝物氨基脲（semicarbazide SEM，純度99.5%）、呋喃妥因代謝物1-氨基-2-內酰脲（1-aminohydantoin AHD，純度99.3%）和呋喃它酮代謝物5-甲基嗎啉-3-2-唑烷基酮（5-morpholinomethy-3-amino-2-oxazolidone AMOZ，99.6%）。氘、碳-13氮-15標記的硝基呋喃類代謝物同位素標準物質（AOZ-D4、SEM-HCl-13C-15N2、AHD-13C3、AMOZ-D5，純度分別為98.7±0.3%、98.5±0.5%、98.7±0.3%、99.5±0.3%），購自WITEGA公司。

硝基呋喃類代謝物標準品用甲醇配成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，保存期為180 d，硝基呋喃類代謝物同位素標準品用甲醇配制成濃度為100 μg/mL的同位素混合標準儲備液，保存期180 d。使用時用純水將標準品和同位素混合內標儲備液逐級稀釋成濃度為10 ng/mL和 100 ng/mL的工作溶液。保存條件：呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物為常溫保存，其它幾種標準物質均為4 ℃條件下保存。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm 1.7 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；梯度洗脫程序如表1。

1.4.2 質譜條件 ESI正離子化模式；儀器型號：Waters Xevo TQS；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測（MRM）；錐孔電壓：40 V； 毛細管電壓：0.9 kV； 脫溶劑氣溫度：500 ℃

1.4.3 樣品前處理方法 水產品取可食部分，經勻漿制肉糜。稱取約2 g樣品（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入50 μL同位素混合內標工作液（100 ng/mL），渦旋震蕩30 s，再加入5 mL 水、1 mL鹽酸溶液（4 mol/L）和300 μL的二硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），渦旋震蕩30 s，置于超聲清洗儀中超聲2 h（溫度控制在35～60 ℃之間）。取出樣品，冷卻至室溫，加入磷酸氫二鉀溶液調pH值至7.4（±0.2），加入4 mL乙酸乙酯漩渦震蕩60 s，4 000 r/min離心5 min，重復提取一次，合并上清液直接過Prime HLB固相萃取小柱，收集濾液至10 mL離心管中，40 ℃下水浴氮氣吹干，準確加入1 mL甲醇溶液（20%），漩渦震蕩混合2 min，過0.22 μm濾膜，待上機檢測。endprint

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

本方法選擇了ACQUITY UPLC BEH C18柱，該色譜柱在保證良好分離效果的基礎上，縮短了一半的分離時間。比較了以乙腈-水和甲醇-水溶液作為流動相，對于硝基呋喃類代謝物的色譜分離效果，結果發現，甲醇-水作為流動相更有利于目標物的分離，能夠得到更好的線性關系，并能獲得較低的檢出限，提高了分析的靈敏度。

2.2 質譜條件的優化

參考相關標準和文獻選定硝基呋喃類代謝物相應的定量、定性子離子，并結合儀器的實際情況，分別對錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等進行充分的優化，優化條件如表2。

2.3 前處理方法的選擇

水解和衍生化條件：按照上述方法在35～60 ℃水浴中超聲，結果表明水浴溫度對測定結果沒有顯著影響，衍生時間為120 min時可使實際樣品中與蛋白結合的硝基呋喃類代謝物水解較充分，并使衍生化反應順利進行。

水產品樣品中含有大量磷脂、脂肪等親脂性雜質，干擾了目標化合物的分析，同時降低色譜柱的使用壽命，易污染質譜，并嚴重影響檢測結果的重現性。本方法采用乙酸乙酯提取液直接通過Oasia PRiME HLB固相萃取柱，將干擾物質吸附于固相萃取柱中。該SPE柱對磷脂、脂肪等親脂性雜質凈化效果較好，并且對目標化合物無吸附作用。經凈化后的樣品氮吹干后直接定容，不需正己烷去脂、離心等操作。相較一般的固相萃取省去了溶劑轉換過程，縮短了檢測時間。

2.4 儀器線性范圍和檢出限、定量限的測定

在系列標準溶液中加入50 μL同位素混合內標，按上述實驗步驟操作，以硝基呋喃代謝物濃度為橫坐標，以各特征離子質量色譜峰面積與相應內標的峰面積比為總坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程和相關系數如表3。結果表明線性范圍為0.05～10 μg/kg，且相關系數均達到0.99以上。以3倍信噪比計算方法的檢出限，以10倍信噪比確定方法的定量限，經確證得出結果見表3。計算信噪比相對標準偏差（RSD）分別為AOZ 2.38%、AMOZ 3.06%、SCA 2.83%、AHD 2.89%，均在允許范圍內。

2.5 方法的精密度和回收率

取不含硝基呋喃類藥物的樣品，準確稱取2.00 g，分別做4種硝基呋喃類代謝物的5個添加水平，濃度從0.025～2 μg/kg，每個做3份平行，按照樣品的操作過程進行提取、凈化和測定，每個添加水平在相同條件下做6個平行樣品，用標準曲線校準樣品，計算每個樣品的濃度，計算加標回收率、相對標準偏差（RSD）如表4：

2.6 樣品分析

按照本文方法對2017年農業部考核樣品進行檢測，回收率在70%～120%之間，檢測結果合格，說明該方法能夠達到檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的要求。

3 結論

本工作建立了水產品中硝基呋喃類代謝物的快速檢測方法，該方法與傳統方法比較，操作簡單快速，有效縮短了檢測時間，靈敏度高、穩定性好，結果重現性好，可廣泛用于大批量水產品中硝基呋喃類代謝物的高效快速檢測。

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