咪達唑侖對山羊不同腦區單胺類神經遞質影響的研究

高 利， 郭 岑， 李欣然， 朱漢民， 陳宇航， 張思學

(1.東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030； 2.內蒙古扎魯特旗農牧業局北鎮獸醫院 ， 內蒙古 通遼 028000)

咪達唑侖對山羊不同腦區單胺類神經遞質影響的研究

高 利1， 郭 岑1， 李欣然1， 朱漢民1， 陳宇航2， 張思學1

(1.東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030； 2.內蒙古扎魯特旗農牧業局北鎮獸醫院 ， 內蒙古 通遼 028000)

為了研究咪達唑侖對山羊各腦區單胺類神經遞質的影響，探討咪達唑侖的作用部位及機制。將25只山羊隨機分為5組，分別為對照組、誘導組、麻醉組、恢復Ⅰ組和恢復Ⅱ組。連續觀察山羊行為學變化，并于相應時間點采取腦組織，通過高效液相色譜(HPLC)法檢測5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)的含量。結果顯示，咪達唑侖主要作用部位是大腦和腦干，使5-HT和5-HIAA的含量升高，NE和DA的含量降低。

咪達唑侖 ； 山羊 ； 5-HT ； 5-HIAA ； NE ； DA

咪達唑侖(Midazolam)作為新一代苯二氮卓類藥物，臨床療效好，不良反應輕，成為目前發展較快的一類藥物，常用作抗焦慮、催眠、鎮靜[1]，在獸醫臨床多與其他藥物合用來增強效果[2-3]。咪達唑侖的治療效果和副作用是因為對GABAA受體的作用，但咪達唑侖并不直接激活GABAA受體，和其他苯二氮卓類藥物一樣，它增強了神經遞質GABA對GABAA受體的作用，對中樞神經系統產生了抑制效應。5-HT、5-HIAA、DA和NE是機體內重要的單胺類神經遞質，在中樞神經系統中起重要作用。反芻動物腦內單胺類神經遞質含量的準確測定，對臨床診斷和基礎生理研究具有重要意義[4]。試驗以山羊為研究對象，旨在研究咪達唑侖對山羊不同腦區單胺類神經遞質的影響，根據不同腦區內單胺類神經遞質在麻醉過程中的變化趨勢，探討咪達唑侖的作用部位及機制，為臨床麻醉中合理有效地配伍麻醉藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 臨床檢查健康的山羊25只，體重為12～16 kg，雌雄不限，購自哈爾濱市香坊區某養殖場，嚴格按照試驗動物要求進行飼養管理。

1.2 試驗儀器及藥品 Waters 600高效液相色譜儀，Waters 2489UV檢測器，Waters 2707自動進樣器，色譜柱，購自美國Waters公司；5-HT、5-HIAA、NE、DA、色譜級甲醇、色譜級乙腈，均購自Sigma公司；純度≥98.0%；咪達唑侖，純度：99.8%，東北農業大學動物醫學學院外科教研室提供。

1.3 試驗分組 將山羊隨機分為5組，即對照組、誘導組、麻醉組、恢復Ⅰ組和恢復Ⅱ組，每組5只。除對照組外的山羊按體重肌肉注射咪達唑侖14 mg/kg體重，對照組山羊按體重肌肉注射生理鹽水1.31 mL/kg體重。行為學變化分組標準：誘導期組：站立不穩，倒地，翻正反射即將消失；麻醉期組：將動物腹面朝上放置，給予輕微刺激，動物仍不能翻回者為翻正反射消失；恢復Ⅰ期組：對麻醉后翻正反射消失的動物，給予輕微的刺激，動物即能自主翻回者，為翻正反射恢復；恢復Ⅱ期組：為翻正反射恢復后6 h。該期動物基本蘇醒，能夠自由走動，并主動飲水和覓食。

1.4 腦組織樣品采取 處死山羊后，剪開頭皮，同時除去硬腦膜并鋸開頭蓋骨，小心分離出完整的腦組織，用4 ℃生理鹽水沖洗，除去附著的血液。在冰板上快速取雙側大腦皮層、小腦、丘腦、腦干和海馬，用濾紙吸干水分后放入凍存管中稱重，然后-80 ℃冰箱中保存。

1.5 定量方法 采用RP-HPLC外標法測定，數據處理系統可自動計算峰面積或根據具體峰形進行手動積分。根據標準品的峰面積作出標準曲線，將每個待測樣品的峰面積的平均值代入標準曲線，即可算出各自的濃度。

1.6 線性范圍和相關系數 精密量取單胺混合標準儲備液，用提取液分別稀釋成2、5、10、50、100、200、500 ng/mL的對照液。取20 μL進樣。以吸收峰的峰面積對應含量作線性回歸，求得4種遞質的回歸方程和相關系數。

1.7 加樣回收率 取1份已知濃度的丘腦組織勻漿液樣品分成3份，分別加入等體積的低、中、高3種濃度單胺類混合標準液，按樣品的處理方法制樣并測定，所得的峰面積帶入到相應的標準曲線回歸方程中，得到所測單胺濃度，按下面公式計算各相應濃度的回收率：回收率(%)=測后單胺組織濃度/已知單胺組織濃度×100%。

1.8 精密度 (1)日內差測定：同一濃度水平的混合標準液于1 d內分別進行4次重復進樣測定峰面積和變異系數；(2)日間差測定：對同一濃度水平的混合標準液分4 d 4次進樣測定峰面積和變異系數。

1.9 最低檢測限的測定 取空白樣品，按照樣品處理程序處理后上機測定。另取多份空白樣品，分別加入不同的較低濃度(如0.25、0.5、1、2、5 ng/mL)的單胺混合標準液，按照樣品處理程序處理后上機測定，對比兩者，即可得出樣品中各單胺遞質的最低檢測限。

1.10 數據分析 用平均值±標準差表示數據。所有結果通過SPSS 19軟件數據分析系統做單因素方差分析，Pgt;0.05為差異不顯著，Plt;0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 4種單胺類神經遞質分離結果 在規定色譜條件下，4種單胺類神經遞質得到有效分離，保留時間為：NE(4.05 min)、DA(6.92 min)、5-HT(11.03 min)、5-HTAA(14.21 min)。各峰無干擾及拖尾現象。所得標準品色譜圖及樣品色譜圖見圖1和圖2。

圖1 單胺類神經遞質標準品色譜圖

圖2 丘腦中單胺類神經遞質樣品色譜圖

2.2 線性范圍 按指定色譜條件進樣，以峰面積(Y)與標準品濃度(X)進行線性回歸，回歸方程Y=aX+b。結果表明，4種單胺類神經遞質在2-500 ng/mL范圍內濃度與峰面積呈線性相關，相關系數R2均達0.99。標準曲線回歸方程及相關系數見表1。結果如下。

表1 線性方程和相關系數(R2)

2.3 加樣回收率試驗結果 回收率是反映從制樣到HPLC測量等環節誤差大小及間接反映測定準確程度的一個重要指標。由表中數據可知，NE、DA、5-HT和5-HTAA的平均回收率分別為94.73%、96.24%、100.23%和95.40%。結果表明，采用本試驗的樣品處理方法，回收率高且穩定，色譜條件可靠，符合試驗要求。

2.4 最低檢測濃度 以引起3倍基線噪音的含量為最低檢測限，4種單胺類神經遞質NE、DA、5-HT、5-HIAA的最低檢測限分別是2 ng/mL、5 ng/mL、5 ng/mL和5 ng/mL。

2.5 精密度試驗結果 結果表明，NE、DA、5-HT和5-HIAA 4種單胺類神經遞質日內差變異系數分別為3.2%、3.5%、2.8%和3.7%；日間差變異系數分別為3.5%、3.1%、2.7%和3.8%。變異系數均在4.0%以下，表明該檢測方法穩定、重現性良好。

表2 加樣回收率結果

2.6 咪達唑侖對山羊不同腦區5-HT的影響 如表3所示，山羊肌肉注射咪達唑侖后麻醉組大腦和腦干內5-HT含量均顯著升高，與對照組比較分別升高了42.55%(Plt;0.01)和46.58%(Plt;0.01)；在恢復Ⅰ期和恢復Ⅱ期時，大腦和腦干內5-HT含量均顯著恢復，同時與麻醉期比較差異顯著或極顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)。其他腦區內5-HT含量無顯著變化。

表3 咪達唑侖對山羊不同腦區5-HT的影響 (n=5，ng/mL)

注：a **：與對照組比較Plt;0.01， 差異極顯著； *：與對照組比較Plt;0.05，差異顯著；b ##：與麻醉期比較Plt;0.01，差異極顯著； #：與對照組比較Plt;0.05，差異顯著，下表同

2.7 咪達唑侖對山羊不同腦區5-HIAA的影響 如表4所示，山羊肌肉注射咪達唑侖后麻醉組大腦和腦干內5-HIAA含量均顯著升高，與對照組比較分別升高了37.19%(Plt;0.01)和51.73%(Plt;0.01)；在恢復Ⅰ期和恢復Ⅱ期時，大腦和腦干內的5-HIAA含量均顯著恢復，同時與麻醉期比較差異顯著或極顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)。其他腦區內5-HIAA含量無顯著變化。

表4 咪達唑侖對山羊不同腦區5-HIAA的影響 (n=5，ng/mL)

2.8 咪達唑侖對山羊不同腦區NE的影響 如表5所示，山羊肌肉注射咪達唑侖后，麻醉組大腦和腦干內NE含量均顯著降低，與對照組比較分別降低了37.71%(Plt;0.01)和31.92%(Plt;0.01)；在恢復Ⅰ期和恢復Ⅱ期時，大腦和腦干內NE的含量均顯著恢復，同時與麻醉組比較差異極顯著(Plt;0.01)。其他腦區內NE含量無顯著變化。

表5 咪達唑侖對山羊不同腦區NE的影響 (n=5，ng/mL)

2.9 咪達唑侖對山羊不同腦區DA的影響 如表6所示,山羊肌肉注射咪達唑侖后，麻醉組大腦和腦干內DA含量均顯著降低，與對照組比較分別降低了44.80%(Plt;0.01)和35.81%(Plt;0.05)；在恢復Ⅰ期和恢復Ⅱ期時，大腦和腦干內DA含量均顯著恢復，同時與麻醉組比較差異極顯著(Plt;0.01)。其他腦區內DA含量無顯著變化。

表6 咪達唑侖對山羊不同腦區DA的影響 (n=5，ng/mL)

3 討論

組織液和體液中的單胺類神經遞質及其代謝物的含量，能反映出生理和疾病的狀態，而腦內單胺類神經遞質含量的準確測定，對臨床診斷和基礎生理研究具有重要意義[4,5]。5-HT在大腦皮層、基底節和下丘腦的部分神經元上起抑制作用，而對深部的神經元常起到興奮作用。其參與痛覺調節、覺醒-睡眠周期調節和下丘腦-垂體的神經內分泌調節等多種活動。姚尚龍[6]等研究異丙酚不同麻醉深度下兔腦5-HT代謝水平的改變，結果顯示，大腦5-HT水平在麻醉后顯著增加。上述研究與本試驗麻醉期腦組織中5-HT含量的變化趨勢相似。在恢復II期時腦組織中5-HT含量恢復至正常水平，推測咪達唑侖的作用時間短和順行性遺忘作用與其相關。有研究表明，給予大鼠嗎啡可使中樞神經系統5-HT的含量增加50%，阿片類藥物可以阻礙GABA能神經元對于5-HT神經元的抑制，從而導致5-HT釋放增多。但關于苯二氮卓類藥物對5-HT的影響變化未見報道，所以本試驗中咪達唑侖使5-HT含量升高原因是否與5-HT受體有聯系尚需進一步研究。

腦內5-HIAA是由5-HT經單胺氧化酶的氧化作用生成，在體內5-HIAA隨著5-HT含量的變化呈現一定規律性的變化。劉紅亮[7]等應用全麻藥異丙酚麻醉大鼠，觀察大腦皮層5-HT和其代謝產物5-HIAA的變化，結果發現，持續靜脈注射異丙酚可引起5-HT和5-HIAA的升高，停止注射后又很快降至用藥前的基礎水平。本試驗結果顯示，麻醉期5-HIAA在大腦和腦干中的含量顯著升高，恢復II期時5-HIAA含量恢復至正常水平。不同的麻醉鎮靜藥物如嗎啡、羥甲芬太尼等對腦內單胺類神經遞質含量的影響研究多證明麻醉藥物可使腦內5-HIAA的含量升高。結合本次研究我們認為咪達唑侖可增加大腦和腦干中5-HIAA的釋放作用，并提高神經元興奮性，但作用機制是否與BZ受體激動劑激活單胺氧化酶的活性有關還需進一步的研究。

NE主要由交感節后神經元和腦內腎上腺素能神經末梢合成和分泌，主要激動α受體，具有很強的血管收縮作用，可保證對重要器官的血液供應。山羊肌肉注射咪達唑侖后，山羊大腦和腦干NE的含量在麻醉期顯著降低，在恢復II期時恢復至正常水平，其他腦區NE的含量沒有顯著變化。沈浩等[8]研究咪唑安定、丙泊酚對下丘腦室旁核去甲腎上腺素釋放和心率變異性的影響，發現可引起NE含量的顯著下降。本試驗結果與上述文獻報道相似，咪達唑侖可降低山羊大腦和腦干中NE的含量，分析原因可能是咪達唑侖作用于藍斑核的GABAA受體，導致NE能神經元受到抑制，從而使NE釋放減少。

DA是一種神經傳導物質，用來幫助細胞傳送脈沖的化學物質，其參與調節肌緊張以及精神活動。DA是合成NE的前體，抑制DA的釋放會導致NE的合成減少。山羊肌肉注射咪達唑侖后，大腦和腦干DA的含量在麻醉期顯著降低，此變化趨勢與張燕等[9]報道的小型豬復合麻醉劑對大鼠腦中單胺類神經遞質含量的影響相似。在恢復I期時大腦和腦干內DA的含量都恢復至正常水平，其恢復的原因可能是由于BZ(苯=氮卓類化合物)受體激動劑與神經元中的Cl-同時作用于離子通道靶位，并加快藥物進出于離子通道的速率所導致。

4結論

咪達唑侖的作用部位主要是在大腦和腦干，使大腦和腦干內5-HT和5-HIAA的含量升高，大腦和腦干內NE和DA的含量降低，提示單胺類神經遞質參與咪達唑侖全身麻醉作用的調控。

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[3] 李強，張衛，謝積勝. 咪達唑侖聯合氯胺酮在巴馬香豬腮腺核磁共振檢查中的麻醉效果[J]. 廣西醫學，2015,37(9):1 219-1 221

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[9] 張燕, 王洪斌, 范宏剛. 噻環乙胺及小型豬復合麻醉劑(XFM)對大鼠不同腦區單胺類神經遞質的影響[J]. 中國獸醫科學, 2010, 40(1): 93-97.

Effectsofmidazolamonmonoamineneurotransmittersindifferentencephalicregionsofgoats

GAO Li1, GUO Cen1, LI Xin-ran1, ZHU Han-min1, CHEN Yu-hang2, ZHANG Si-xue1

(1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China ； 2.Veterinary Hospital of north village, husbandry bureau of Jarud Banner， inner Mongolia，Tongliao 028000,China)

To study the effects of midazolam on monoamine neurotransmitters in different encephalic regions of goats, and then investigate the anesthetic mechanism of midazolam on the brain, 25 goats were divided randomly into control group, induction group, maintenance of anesthesia group, recovery-from-anesthesia I group, recovery-from-anesthesia II group. In different anesthetic periods, and the content of amino acid neurotransmitters in different encephalic regions of goats were detected by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that midazolam main site of the brain and brain stem, and the content of 5-HT and 5-HIAA was increased, and reducing the content of NE and DA was reduced.

Midazolam ; Goats ; 5-HT ; 5-HIAA ; NE ; DA

S857.144

A

0529-6005(2017)10-0102-05

2017-04-10

黑龍江省教育廳項目(12531016)

高利(1972-)，男，教授，博士，研究方向為動物臨床麻醉，E-mail：gaoli43450@163.com