二次諧波顯微成像技術

郝淑娟+崔海瑛+何巍巍+邱忠陽+丁軍榮

摘要：二次諧波顯微成像技術是一種新型的非線性光學成像方法，在生物醫學成像、新型材料科學等領域都有十分廣泛的應用。本文介紹了光學二次諧波顯微成像的產生原理、主要特點和其技術發展應用。

關鍵詞：二次諧波；顯微成像；應用

中圖分類號：G712 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）52-0194-02

微觀世界的很多有用信息可以通過采用顯微技術獲得，顯微成像技術在生命科學、醫學、工業測量等不同領域有著巨大的研究價值和廣泛的應用，因此，顯微成像技術一直是人們研究的熱點。非光學顯微術，如電子顯微技術、掃描隧道顯微技術等，存在對觀察樣品環境要求嚴格、對觀察對象造成傷害、對觀察樣品限制較多等弱點，而光學顯微術沒有這些弱點缺陷，因此，光學顯微術的發展完善和功能拓展具有重要意義。近年來，計算機技術、激光技術和精密機械電子等技術得到飛速發展，隨著這些技術的提高，出現了激光共焦掃描顯微成像技術、雙光子激光掃描共聚焦顯微成像技術、光學相干層析成像等很多種不同功能和特性的現代光學顯微術。二次諧波顯微成像技術是其中的一種現代非線性光學顯微術，它利用光與物質相互作用時產生的二次諧波信號進行顯微成像或探測。

一、二次諧波顯微成像原理

在非線性光學過程中，在強激光作用下的非線性介質，其電極化強度與激發光場的關系可以表示為[1]：

二次諧波產生過程是和頻過程的一種特殊情況，即倍頻。倍頻效應是指兩個頻率相同的入射光發生和頻作用，其輸出光波的頻率為入射光場頻率的二倍，其中入射光波稱為基頻，輸出倍頻光波稱為二次諧波。相應的極化強度為：

二次諧波產生過程也可以看作是不同頻率光子的交換過程。兩個頻率為ω的光子在諧波產生過程中湮滅，同時生成一個新的光子，頻率為2ω。

二次諧波產生需要滿足兩個條件：一是要求介質要具有非中心對稱性。在電偶極子近似下，具有中心對稱性的介質，其二階電極化率張量為零，則不能產生二次諧波信號。二是要求滿足相位匹配條件。相位匹配直接決定一個非線性光學過程的效率。如果二次諧波產生過程中完全滿足相位匹配條件，則傳播中的倍頻光波和不斷產生的倍頻極化波之間保持相位的一致性，相互干涉，產生的二次諧波強度由零開始逐漸增大，直至基頻波的功率完全轉為二次諧波的功率，獲得最大的二次諧波輸出功率。

二次諧波顯微成像裝置由四個部分組成：第一部分是光源，通常需要提供功率適中的激發光，既可以保證產生較強的二次諧波信號，也可以避免樣品受損。在二次諧波顯微技術中光源通常采用可在整個紅外區內可調諧的摻鈦藍寶石飛秒激光器。第二部分是物鏡，可以減小激發光的激發區域，并收集樣品產生的非軸向輻射的二次諧波信號，避免能量損失。通常采用數值孔徑足夠大的物鏡。第三部分是濾光片組，可保證收集到的信號為二次諧波信號，過濾干擾信號。在前向探測模式中，通常采用短通濾光片和窄帶濾光片，在背向探測模式中，通常采用窄帶濾光片。第四部分為信號探測系統，可以進行二次諧波信號的收集探測。通常采用高靈敏度的PMT探測器，或與激發光源同步的信噪比高的鎖相放大器。

二、二次諧波顯微成像技術特點

不同于其他的現代光學顯微成像技術，二次諧波顯微成像技術由于利于樣品的非線性特性產生的二次諧波信號進行成像和探測，因此，具有以下主要特點：

1.傳統的激光共焦顯微鏡采用共焦小孔成像，二次諧波顯微成像產生的信號光由于非線性效應的強局域特性被局限在焦點附近很小的區域里，在成像過程中非焦點區域發光對測量結果的影響大大減小，因此，它不采用共焦小孔就可以實現高分辨率成像，還具有較高的信噪比，具有較高的三維空間分辨率，并且可以對具有一定厚度的樣品進行層析成像。

2.在二次諧波顯微成像技術中，通常激發光源采用近紅外的飛秒激光器，這樣減小了對生物樣品的光損傷，降低了光漂泊，增加了樣品的穿透深度。

3.二次諧波信號是樣品的原發性信號，成像過程不需要使用染料進行染色，這樣避免了光化學毒性及染色過程中的物理損傷，沒有染色過程也使該技術可用于很多被測樣品不能進行熒光標記的成像探測。

4.利用二次諧波信號進行成像或探測時，二次諧波信號的相干性使其對樣品局部微觀結構具有較高的敏感性，因此探測到的二次諧波信號不僅能反映與樣品有關的強度信息，還可以反映樣品的分子取向、排列方式等局部微觀結構，這些重要而本質的信息可以通過分析信號的角度分布或偏振特性等得到。

5.二次諧波顯微鏡雖未商品化，但雙光子熒光顯微系統已經商品化，二次諧波成像顯微鏡可以很容易地在其基礎上經過簡單改造獲得，如通過更換濾光片改造而成，耗費較小。

6.二次諧波成像顯微鏡可以收集背向信號，可以和其他的成像技術進行同時探測，如雙光子熒光顯微鏡、光學相干層析成像，實現多通道顯微成像或探測，更加有利于進行成像結果對比研究，實現信號互補。

三、二次諧波顯微成像技術的應用

在生命科學領域，二次諧波顯微成像技術由于其無光損傷、無光毒性、無光漂白等特點，在生物組織成像中有廣泛的應用。研究表明，一些結構蛋白如膠原蛋白、肌動球蛋白復合、微管蛋白等，都具有很強的二次諧波信號，不同的膠原蛋白類型在同等激發條件下，呈現不同的二次諧波信號強度，因此二次諧波顯微成像技術可以用于生物組織的結構蛋白成像。生物細胞和組織成像也可以通過二次諧波顯微成像技術實現，Shi-Wei Chu等人曾用此技術觀察到了斑馬魚體內細胞分芽繁殖、原腸胚的形成、組織的形成等晶胚發育過程[2]。Andrew等人用苯乙烯基染劑產生二次諧波信號，研究發現其對膜電壓的敏感度達到40/100mV。二次諧波成像可以實現膜之間分離距離的測量，測量的精度比其他顯微鏡都高。不僅如此，根據二次諧波信號對分子分布的對稱性的依賴，可以實時觀察膜上分子的動力學變化規律，這比通常使用的核磁共振更加方便快捷。因此二次諧波顯微技術在膜成像和動態測量中有重要的應用[3]。另外，二次諧波顯微成像可以對基因組DNA溶液、細胞核提取物、培養細胞的細胞核等不同DNA樣品進行檢測，獲取DNA樣品的二次諧波信號并進行高解析度成像[4]。

在醫學研究領域，二次諧波顯微成像技術在腫瘤、皮膚科、牙科等研究方向都有廣泛的應用。二次諧波顯微成像技術能探測到子宮頸、口腔、食道、耳朵、鼻子等處的粘膜組織的病變，為腫瘤的診斷和分析提供了一份很好的參考，在癌癥的早期診斷中能起到一定的作用。另外，通過二次諧波顯微成像可以實現藥物通透性的活體監控。二次諧波顯微成像技術可以實現牙齒的成像，為牙科提供了一種新的光學診斷方法。此外，該技術還可以在不損傷角膜的情況下觀察到角膜的結構，以及實現對眼底視網膜的成像研究。

在材料科學領域，二次諧波顯微成像技術在納米材料方向中也有廣泛的應用。二次諧波顯微成像技術可以對單個有機納米晶體的取向進行探測，從而判斷納米晶體的晶體類型，也可以通過分析二次諧波信號的偏振特性來分析氧化鋅薄膜的結晶品質和晶體生長取向，還可以通過偏振分析和離焦成像的方法獲得單個KTP納米粒子的三維取向信息和晶軸的歐拉角[5]。對于中心對稱材料，其表面由于對稱性遭到破壞而可以產生表面二次諧波信號，不僅能反映各向同性媒質屬性，還可以反映長程有序材料的晶體結構。

參考文獻：

[1]Boyd R W.Nonlinear Optics.Boston：Academic，1992.

[2]Chu Shi wei，Chen Szu Yu，Tsung Han Tsai，等.非侵入性的多次諧波顯微法用于活體發育生物學研究[J].光學快報：英文版，2003，11（23）.

[3]莊正飛.二次諧波顯微成像及其在前列腺組織中的應用[D].華南師范大學，2007.

[4]羅冬梅，鄧小元，卓雙木，譚淑雯，莊正飛，金鷹.腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發生的非線性光譜學成像[J].光譜學與光譜分析，2012，（3）.

[5]王琳瑞.二次諧波顯微術的尺寸特性和取向探測研究[D].南開大學，2010.