長鏈非編碼RNA H19對骨肉瘤順鉑化療敏感性的影響及機制

李玉椿 (山東大學齊魯醫院青島院區，山東 青島 266000)

長鏈非編碼RNA H19對骨肉瘤順鉑化療敏感性的影響及機制

李玉椿 (山東大學齊魯醫院青島院區，山東 青島 266000)

目的探究長鏈非編碼RNA H19(LncRNA H19，簡稱H19)對骨肉瘤順鉑化療敏感性的影響及相關機制。方法體外利用間歇濃度梯度遞增法在人骨肉瘤細胞系U2OS中構建順鉑抵抗細胞系U2OS-CR，逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測H19表達水平變化。轉染過表達及干擾H19的質粒，構建U2OS過表達H19(U2OS oeH19)細胞系、U2OS干擾H19(U2OS shH19)細胞系及U2OS-CR干擾H19(U2OS-CR shH19)細胞系，MTT檢測細胞系順鉑半抑制濃度(IC50值)的變化，Western印跡及RT-PCR技術檢測U2OS oeH19及U2OS shH19中上皮間充質轉化(EMT)相關分子表達的變化。結果U2OS-CR細胞系IC50值顯著高于親本細胞U2OS(P<0.05)，U2OS-CR細胞系H19表達水平也顯著上調(P<0.05)。U2OS oeH19細胞系順鉑IC50值相比對照細胞出現顯著增高(P<0.05)，U2OS shH19及U2OS-CR shH19細胞系順鉑IC50值相比對照細胞顯著降低(P<0.05)。U2OS oeH19細胞相比對照細胞E-cadherin表達下調，N-cadherin、Vimentin表達上調，U2OS shH19細胞E-cadherin表達上調，N-cadherin、Vimentin表達下調。結論H19可通過促進骨肉瘤細胞EMT進程誘導其順鉑耐藥，針對H19的靶向治療可能提高骨肉瘤的化療療效。

長鏈非編碼RNA H19；骨肉瘤；順鉑；化療敏感性

骨肉瘤是骨組織最常見的原發性惡性腫瘤，其惡性程度高，易發生早期轉移，故盡早開展化學治療對于控制患者病情是極其重要的，然而仍有相當部分患者在接受手術及大劑量化療后發生遠處轉移或復發〔1〕。癌細胞對化療藥物的耐藥是促成骨肉瘤化療失敗的重要原因，目前對于骨肉瘤細胞化療抵抗產生的機制尚不完全清楚。近年許多研究顯示，長鏈非編碼RNA H19 Lnc RNA H19(以下簡稱H19)與多種惡性腫瘤化療抵抗關系密切〔2，3〕，但其在骨肉瘤中的生物學作用還有待證實。本研究擬通過體外實驗明確H19對于骨肉瘤順鉑化療敏感性的影響，并對相關機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1實驗材料 實驗細胞包括人骨肉瘤細胞系U2OS及人胚腎細胞293T(美國ATCC公司)。實驗儀器主要包括ECO1.5超凈工作臺(美國Thermo Scientific公司)，光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，5410臺式高速離心機(德國艾本德公司)，Nanodrop2000c超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，多孔酶標儀(美國Molecular Devices公司)，電泳儀、轉膜儀及GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，Real-time PCR儀(美國Applied Biosystems公司)等。

主要實驗試劑包括McCoy 5A培養基、DMEM培養基及胎牛血清(美國Thermo Scientific Hyclone公司)，轉染脂質體Lipofectamine RNAi MAX Reagent(美國Thermo Scientific公司)，RNA提取試劑RNAiso Reagent、RNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green核酸熒光染料(日本Takara公司)，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(美國Sigma公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Sigma公司)。轉染用的包裝質粒包括PXZ171、NRF、VSV-G(美國addgene公司)。干擾及過表達質粒(中國維真生物公司)。抗體包括上皮間充質轉化(EMT)相關分子：E-cadherin抗體(Ab15148)、N-cadherin抗體(Ab18203)、Vimentin(Ab53519)、β-actin(Ab8226)均購自美國Abcam公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 McCoy 5A培養基+10%胎牛血清培養U2OS細胞，DMEM培養基+10%胎牛血清培養293T細胞，培養條件：37℃，5%CO2，100%相對濕度。傳代比例1∶3。

1.2.2構建U2OS抵抗順鉑組織系U2OS-CR 順鉑間歇濃度梯度遞增法誘導建立U2OS-CR，根據參考文獻〔4〕中采用的順鉑濃度1 μg/ml、3 μg/ml、5 μg/ml、7 μg/ml依次遞增，誘導期間每2～3 d更新含相應濃度順鉑的培養基，待細胞穩定生長1 w以上后使用下一個篩選濃度，直到細胞在7 μg/ml濃度下穩定生長。

1.2.3RT-PCR檢測細胞mRNA表達水平 消化離心收集約1×106個待檢測細胞，加入1 ml RNAiso重懸，嚴格按說明書進行RNA抽提。DEPC水稀釋RNA沉淀至30 μl，檢測RNA濃度，取1 μg行逆轉錄，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行操作。得到的cDNA模板采用SYBR Green法進行RT-PCR檢測，上樣時設置3個平行孔，反應條件：預變性94℃ 4 min；擴增條件94℃ 30 s，60℃ 1 min，總共40個循環。引物見表1。

表1 RT-PCR引物表

1.2.4構建U2OS oeH19、U2OS shH19及U2OS-CR shH19細胞系 接種工具細胞293T于6孔板中，將病毒包裝質粒PXZ171(0.75 μg/孔)、NRF(0.3 μg/孔)、VSV-G(0.45 μg/孔)及目的或對照質粒(1.5 μg/孔)與10 μl轉染脂質體混合，轉入293T細胞中，無血清培養6 h后，加入DMEM培養基+10%胎牛血清培養，48 h后收集病毒懸液，0.45 μm過濾器過濾。接種待感染的細胞于6孔板中，病毒懸液與培養基1∶1混合均勻后加入6孔板，感染2 d后，1 μg/ml嘌呤霉素篩選至細胞生長狀態良好，完成細胞系的構建。轉染過表達質粒的U2OS細胞以U2OS oeH19表示，轉染其相應空載的對照細胞以U2OS oecontrol表示；轉染干擾質粒的U2OS及U2OS-CR細胞分別以U2OS shH19及U2OS-CR shH19表示，轉染其相應空載的對照細胞分別以U2OS shcontrol及U2OS-CR shcontrol表示，干擾載體靶序列為AGTAAAGAAACAGACCCGCTT。

1.2.5MTT檢測細胞IC50值 接種對數生長期的待測細胞于96孔板，濃度為2 000個細胞/孔，設置5個復孔，37℃、5%CO2培養12 h后棄上清，加入含不同濃度梯度順鉑的McCoy 5A培養基，濃度分別為0.5 μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml，4 μg/ml，8 μg/ml、16 μg/ml，處理24 h后，更換為MTT與McCoy 5A培養基的混合液(比例1∶9)避光培養1h，多孔板酶標儀檢測570 nm處吸光度。Graph pad軟件繪制細胞生存曲線，并計算細胞半抑制濃度(IC50)。

1.2.6Western印跡檢測細胞蛋白表達水平 消化離心收集約5×106個待檢測細胞，300 μl裂解液與相應比例的蛋白酶抑制劑混合加入待抽提的細胞中，冰上裂解2 h，13 000 r/min 4℃離心15 min取其上清液，BCA法對蛋白進行定量分析，保證上樣量為50 μg。配制10%聚丙烯酰胺膠，變性蛋白后上樣，80 V穩壓跑膠30 min，120 V穩壓跑膠1 h，濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗 4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，發光液曝光顯影。一抗濃度比為1∶1 000，二抗濃度比為1∶2 000，以β-actin作為內參。

2 結 果

2.1U2OS-CR細胞系的構建 MTT結果顯示U2OS-CR細胞系構建成功，U2OS-CR細胞順鉑IC50值為8.274±0.683，顯著高于U2OS細胞IC50值3.105±0.513，差異存在統計學意義(t=15.38，P<0.05)，見圖1。

圖1 U2OS-CR細胞系順鉑IC50值的變化

2.2U2OS-CR細胞系H19表達情況 RT-PCR結果顯示U2OS-CR細胞H19相對表達水平為0.610±0.049，顯著高于U2OS細胞相對表達水平0.221±0.036，差異有統計學意義(t=5.186，P<0.05)。

2.3U2OS oeH19、U2OS shH19及U2OS-CR shH19細胞系的構建 RT-PCR結果顯示U2OS oeH19、U2OS shH19及U2OS-CR shH19細胞系均構建成功，其中U2OS oeH19細胞系H19相對表達量為0.896±0.106，顯著高于U2OS oecontrol的相對表達量0.261±0.038，差異存在統計學意義(t=6.195，P<0.05)。U2OS shH19細胞系H19相對表達量為0.075±0.011，顯著低于U2OS shcontrol的相對表達量0.267±0.023，差異存在統計學意義(t=7.415，P<0.05)。U2OS-CR shH19細胞系H19相對表達量為0.163±0.027，顯著低于U2OS-CR shcontrol的相對表達量0.653±0.051，差異存在統計學意義(t=8.451，P<0.05)。

2.4U2OS oeH19、U2OS shH19及U2OS-CR shH19細胞系順鉑IC50值的變化 MTT結果顯示U2OS oeH19細胞系順鉑IC50值為4.629±0.712，顯著高于U2OS oecontrol細胞IC50值3.068±0.373(t=4.342，P<0.05)，見圖2A。U2OS shH19細胞系順鉑IC50值為2.165±0.420，顯著低于U2OS shcontrol細胞IC50值3.308±0.479(t=4.012，P<0.05)，見圖2B。U2OS-CR shH19細胞系順鉑IC50值為4.467±0.526，顯著低于U2OS-CR shcontrol細胞IC50值7.962±0.665(t=9.217，P<0.05)，見圖2C。

2.5U2OS oeH19、U2OS shH19細胞系EMT相關分子表達的變化 Western印跡結果顯示U2OS細胞過表達H19后，E-cadherin表達明顯下調，N-cadherin、Vimentin表達明顯上調，見圖3A。而干擾U2OS H19的表達后，E-cadherin表達明顯上調，N-cadherin、Vimentin表達明顯下調，見圖3B。

圖2 U2OS oeH19、U2OS shH19及U2OS-CR shH19細胞系順鉑IC50值的變化

圖A表示U2OS oeH19細胞系中EMT相關分子的表達情況，圖B表示U2OS shH19細胞系中EMT相關分子的表達情況圖3 U2OS oeH19、U2OS shH19中EMT相關分子的表達變化

3 討 論

LncRNA是長度大于200 bp的一類非編碼RNA，缺少開放閱讀框，不參與蛋白質的翻譯，但可通過多種表觀遺傳調控、細胞周期調控及細胞分化調控機制發揮生物學作用，包括剪接調控、染色質重塑及RNA降解等〔5～7〕。表觀遺傳、細胞周期及分化均是影響惡性腫瘤的生物學行為的重要因素，故LncRNA與惡性腫瘤的關系也逐漸被人們所重視。LncRNA H19位于染色體11p15.5上，近年許多研究顯示，其參與多種惡性腫瘤細胞的發生發展及化療抵抗的發生：Wang等〔8〕研究發現H19在肺腺癌中高表達且不利于患者預后，可促進肺腺癌細胞增殖轉移，并介導其對順鉑的耐藥。Zheng等〔2〕在研究中發現卵巢癌中H19可通過影響谷胱甘肽代謝促進卵巢癌細胞對順鉑的耐藥。Si等〔10〕發現H19可通過抑制乳腺癌細胞BIK(bim-like protein)途徑介導的凋亡，促進細胞對紫杉醇類化療藥物的耐藥。Wu等〔10〕研究發現H19不僅可促進結直腸癌細胞的增殖侵襲能力，還可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進結直腸癌細胞對甲氨蝶呤的耐藥。Wu等〔10〕在人腦膠質瘤細胞U251及U87中利用小干擾RNA干擾H19的表達后，發現細胞對替莫唑胺敏感性提高。以上研究均提示H19可促進多種惡性腫瘤化療藥物抵抗的形成，是導致化療失敗的關鍵因子，但其對骨肉瘤化療抵抗的效應尚不明確。

基于上述研究，我們對H19在骨肉瘤順鉑抵抗中的生物學作用進行了探究，結果顯示，U2OS-CR細胞中H19的表達顯著上調，提示H19可能參與骨肉瘤細胞順鉑抵抗的形成。進而通過細胞轉染的方法干擾及過表達U2OS及U2OS-CR細胞的H19，發現在U2OS細胞中過表達H19后，細胞對順鉑的敏感性顯著下降；反之在U2OS及U2OS-CR細胞中干擾H19的表達后，細胞對順鉑的敏感性增加，進一步證實了H19對骨肉瘤順鉑抵抗形成的促進作用。值得一提的是，干擾U2OS-CR細胞H19的表達后，其H19的表達雖與野生型U2OS細胞H19的表達無顯著差異，但U2OS-CR shH19細胞順鉑的IC50值仍顯著高于野生型U2OS細胞，推測可能原因是骨肉瘤細胞順鉑抵抗的形成并非單一因素決定，U2OS-CR細胞順鉑耐藥性的形成涉及多種耐藥基因的共同作用，H19僅作為其中的關鍵基因之一，故U2OS-CR shH19細胞的順鉑耐藥性仍維持在較高水平。對H19介導骨肉瘤順鉑耐藥可能的相關機制進行探究，EMT作為細胞惡性轉化進程中的關鍵步驟，與腫瘤細胞化療抵抗的形成存在密切關系〔11～13〕。E-cadherin作為EMT標志物之一，是介導細胞間相互聚集黏附的重要分子，其表達的下調往往意味著細胞活動性增加、侵襲轉移能力增強〔14〕。有研究顯示在惡性腫瘤耐藥細胞株中上調E-cadherin的表達可使其化療敏感性恢復〔15〕。N-cadherin、Vimentin是間質細胞表達的標志性分子〔16，17〕，其高表達可促進細胞遷移，并促進細胞化療敏感性的降低〔18，19〕。本研究結果顯示，H19具有促進骨肉瘤細胞EMT進程的作用，提示H19可能通過該途徑發揮介導骨肉瘤細胞對順鉑耐藥的生物學作用。

綜上所述，可以認為H19通過促進EMT進程在骨肉瘤細胞順鉑抵抗的形成中發揮重要的促進作用，筆者將通過進一步體內外實驗，確認H19對骨肉瘤細胞增殖侵襲能力的影響，對其相互作用分子及位點進行深入分析，同時對患者進行長期隨訪，明確H19表達與患者預后的關系，以期為H19對骨肉瘤患者的診斷、靶向治療及預后評估提供新的依據。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6043-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.017

李玉椿(1968-)，男，副主任醫師，主要從事骨腫瘤研究。

〔2017-04-10修回〕

(編輯 李相軍)