IRX1、IRX2基因在原發性肝癌組織細胞中的表達及其對肝癌細胞的免疫保護作用

劉良田 許海濤 唐永華

原發性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一, 我國每年死于肝癌的患者超過11萬, 已占我國腫瘤死因的第2位［1］。有資料表明, IRX1、IRX2與肝癌細胞發展相關［2］。本次研究分析肝癌細胞中IR X1、IRX2表達情況, 觀察其對細胞免疫功能的影響, 以期為肝癌的治療提供一個新的方向?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 選擇本院和光明新區等醫院2014年2月～2017年8月收治的60例進行HCC手術患者的新鮮標本作為研究對象, 所有患者術前均未接受放化療。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 60例HCC標本均取癌組織、癌旁組織和遠癌肝組織,肉眼觀距腫瘤邊界2 cm以內的非癌組織為癌旁組織, 2 cm以上為遠癌肝組織。所有標本離體后立即取0.5 cm×0.5 cm 大小的組織塊, 迅速置于液氮罐中, 于-80℃低溫冰箱內保存, 以備檢測。

1.2.2 臨床資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤大小、是否包膜、腫瘤分化程度、有無鏡下脈管癌栓、復發情況、甲胎蛋白(AFP)、是否合并乙肝或淋巴結轉移、是否有肝硬化、TNM分期、術后生存時間。

1.2.3 SP法檢測 根據SP檢測說明書按照步驟進行操作, 結果判斷：染色后的切片采取雙盲的方法, 由兩位病理醫師根據染色的強度和陽性細胞的百分比, 獨立進行半定量評分(HSCORE), 若切片 HSCORE＞100 判斷為陽性,HSCORE≤100 判斷為陰性。

1.2.4 RT-PCR檢測 ①總RNA的提?。翰捎肧imply P總RNA提取試劑盒說明書提取兩種細胞的總RNA。②互補脫氧核糖核酸(cDNA)的合成：按照cDNA合成說明書進行。③PCR反應及凝膠電泳：根據說明書進行。

1.3 檢測標本及指標

1.3.1 肝癌及癌旁組織檢測 以60例肝癌組織和60例癌旁組織為研究對象, 采用RT-PCR法檢測IRX1、IRX2mRNA表達情況, 采用SP法檢測IRX1、IRX2蛋白表達情況。

1.3.2 肝癌組織檢測 以60例肝癌組織為研究對象, 采用SP法檢測IRX1、IRX2蛋白表達情況, 并將60例肝癌組織按照病理分期分為高分化組21例、中分化組20例、低分化組19例, 比較其IRX1、IRX2蛋白表達差異。

1.4 載體構建及轉染 將人肝癌細胞分為IRX1高表達組、IRX2高表達組、IRX1正常表達組及IRX2正常表達組四組,采用載體構建及轉染的方式將IRX1、IRX2基因注入人肝癌細胞中, 使用細胞增殖 MTT法檢測SMMC-7721細胞, 在酶聯儀(Biorad M-550)上測定490 nm波長處的吸光值, 使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況和周期變化。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s), 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗；采用趨勢卡方檢驗和秩和檢驗分析蛋白表達數據與臨床病理特征間的關系。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌及癌旁組織檢測

2.1.1 IRX1、IRX2 mRNA表達 mRNA表達結果顯示, 肝癌組織中IRX1 mRNA表達量為(13.81±3.29)明顯高于癌旁組織的(6.52±2.84), 差異具有統計學意義(P＜0.05)。肝癌組織中IRX2 mRNA表達量為(4.62±1.83)明顯低于癌旁組織的(9.37±2.59), 差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.1.2 IRX1、IRX2蛋白表達 肝癌組織中的IRX1蛋白陽性表達例數顯著多于癌旁組織, IRX2蛋白陽性表達例數少于癌旁組織, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 肺癌及癌旁組織IRX1、IRX2蛋白表達情況(n)

2.2 肝癌組織檢測 IRX1基因表達程度與腫瘤分化程度呈負相關, IRX2基因表達程度與腫瘤分化程度呈正相關。見表2。

表2 三組肝癌組織IRX1、IRX2表達情況(n)

2.3 IRX1、IRX2不同表達組細胞增殖變化 IRX1高表達組37例, IRX1正常表達組14例, IRX2高表達組24例,IRX2正常表達組27例。MTT檢測后IRX1高表達組A490顯著低于IRX1正常表達組, IRX2高表達組A490顯著高于IRX2正常表達組, 差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 IRX1、IRX2不同表達組細胞增殖變化( ±s)

表3 IRX1、IRX2不同表達組細胞增殖變化( ±s)

注：與相同基因正常表達組比較, aP＜0.05

24 h 48 h IRX1高表達組 37 0.68±0.07a 0.57±0.05a IRX1正常表達組 14 0.83±0.09 0.74±0.08 IRX2高表達組 24 0.84±0.10a 0.76±0.08a IRX2正常表達組 27 0.66±0.06 0.59±0.06組別 例數A490

2.4 IRX1、IRX2不同表達組細胞凋亡變化 IRX1高表達組細胞凋亡總比例顯著高于IRX1正常表達組, IRX2高表達組細胞凋亡總比例顯著低于IRX2正常表達組, 差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 IRX1、IRX2不同表達組細胞凋亡變化( ±s)

表4 IRX1、IRX2不同表達組細胞凋亡變化( ±s)

注：與相同基因正常表達組比較, aP＜0.05

24 h 48 h IRX1高表達組 37 66.48±6.27a 57.51±5.35a IRX1正常表達組 14 50.83±5.26 42.74±4.18 IRX2高表達組 24 52.39±5.43a 41.39±4.11a IRX2正常表達組 27 61.74±6.10 50.86±5.25組別 例數 凋亡總比例(%)

2.5 IRX1、IRX2不同表達組細胞周期變化 IRX1高表達組G0/G1、G2/M期顯著低于IRX1正常表達組, S期顯著高于IRX1正常表達組；IRX2高表達組G0/G1、G2/M期顯著高于IRX2正常表達組, S期顯著低于IRX2正常表達組, 差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見表5。

表5 IRX1、IRX2不同表達組細胞周期變化( ±s)

表5 IRX1、IRX2不同表達組細胞周期變化( ±s)

注：與相同基因正常表達組比較, aP＜0.05

組別 例數 G0/G1 S G2/M IRX1 高表達組 37 74.35±5.82a 18.63±1.37a 0.27±0.03a IRX1正常表達組 14 80.21±6.57 17.35±1.12 1.31±0.15 IRX2 高表達組 24 81.03±6.62a 17.42±1.15a 1.33±0.17a IRX2正常表達組 27 73.29±5.76 18.71±1.38 0.31±0.04

3 討論

IRX1、IRX2基因屬易洛魁家族同源盒基因, 是一簇與胚胎發育密切相關的基因, 編碼參與神經系統發育的具有轉錄因子組合活性的家族蛋白［3］。Rapidis等［4］研究發現, 頭頸癌細胞株過表達IRX1基因后, 細胞增殖和體外形成能力降低。IRX1 基因參與胃癌的發生發展, 在人胃癌細胞系及胃癌動物模型中過表達, IRX1 基因可抑制胃癌細胞增殖、凋亡、死亡、侵襲、遷移及小鼠皮下成瘤能力［5］。余爽等［6］研究中發現HCC組織中IRX2的表達水平低于癌旁組織, IRX2的異常表達與HCC的分化程度有關。大量研究表明, IRX基因在腫瘤的發生發展過程中具有重要意義［7-10］。

為探討IRX1、IRX2基因在HCC組織細胞中的表達及其對肝癌細胞的免疫保護作用, 本次研究將60例HCC手術新鮮標本作為研究對象, 結果顯示, 原發性肝癌組織細胞中IRX1的mRNA表達量明顯高于癌旁組織, IRX2mRNA表達量明顯低于癌旁組織, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。IRX1與IRX2在肝癌組織中的陽性表達例數顯著多于癌旁組織,差異具有統計學意義(P＜0.05)；IRX1基因表達程度與腫瘤分化程度呈負相關, IRX2基因表達程度與腫瘤分化程度呈正相關。IRX1高表達組37例, IRX1正常表達組14例, IRX2高表達組24例, IRX2正常表達組27例。MTT檢測后IRX1高表達組A490顯著低于IRX1正常表達組, IRX2高表達組A490顯著高于IRX2正常表達組, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。表明IRX1高表達可以抑制癌細胞增殖, IRX2高表達會促進癌細胞增殖。IRX1高表達組細胞凋亡總比例顯著高于IRX1正常表達組, IRX2高表達組細胞凋亡總比例顯著低于IRX2正常表達組。表明IRX1高表達能夠促進癌細胞凋亡, 而IRX2高表達會減緩癌細胞凋亡。IRX1高表達組G0/G1、G2/M期顯著低于IRX1正常表達組, S期顯著高于IRX1正常表達組, 差異具有統計學意義(P＜0.05)；IRX2高表達組G0/G1、G2/M期顯著高于IRX2正常表達組, S期顯著低于IRX2正常表達組, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。表明IRX1高表達會使癌細胞G0/G1、G2/M期阻滯, S期延長, 提示癌細胞周期進程減緩, 生殖受到抑制；IRX1高表達會使癌細胞G0/G1、G2/M期延長, S期阻滯, 提示癌細胞周期進程加快, 促進生殖。

綜上所述, IRX1基因表達程度與腫瘤分化程度呈負相關, IRX2基因表達程度與腫瘤分化程度呈正相關；IRX1基因高表達能夠抑制癌細胞生長增殖, 促進其凋亡, IRX2基因高表達能夠促進癌細胞生長增殖, 減緩其凋亡；兩者均是肝癌細胞發展變化的重要指標。但本研究尚未探究清楚IRX1、IRX2基因抑制或促進細胞增殖、凋亡、介導周期停滯機制,還需進行更加深入的研究。

［1］ Zhao R, Wu Y, Wang T, et al.Elevated Src expression associated with hepatocellular carcinoma metastasis in northern Chinese patients.Oncol Lett, 2015 , 10(5):3026-3034.

［2］ 周薇, 趙龍鳳, 徐恩偉.同源盒基因家族與腫瘤關系的研究進展.中國藥物與臨床, 2016, 16(4):532-535.

［3］ 張鵬幸, 曾偉濤, 劉輝, 等.易洛魁家族同源盒基因IRX1在膠質瘤中的表達研究.現代生物醫學進展, 2017, 17(7):1229-1232.

［4］ Rapidis AD, Wolf GT.Immunotherapy of head and neck cancer:current and future considerations.Journal of Oncology, 2009,2009(3):346345.

［5］ Guo X, Liu W, Pan Y, et al.Homeobox gene IRX1 is a tumor suppressor gene in gastric carcinoma.Oncogene, 2010, 29(27):3908.

［6］ 余爽, 王靜, 董冰, 等.IRX2基因在原發性肝癌中表達的初步研究.解放軍醫學雜志, 2013, 38(3):185-189.

［7］ 王斌, 張遜.同源盒基因與腫瘤的研究進展.醫學綜述, 2017,23(7):1329-1333.

［8］ Lu J, Song G, Tang Q, et al.IRX1 hypomethylation promotes osteosarcoma metastasis via induction of CXCL14/NF-κB signaling.Journal of Clinical Investigation, 2015, 125(5):1839.

［9］ 楊惠潔.IRX1基因在原發性肝癌中的表達研究.重慶醫科大學, 2012.

［10］ 許海濤, 劉良田, 唐永華, 等.同源基因IRX1在原發性肝癌中的表達及其臨床意義.中國當代醫藥, 2017, 24(14):4-6.