分子標記技術及其在果樹種質資源上的應用分析

陳薇薇

摘 要 分子標記技術是一種遺傳標記技術，其具有特別的優越性，在生物學領域中被廣泛應用，對各種動植物的長效發展具有重要的推動作用。基于此，將分子標記技術及其在果樹種質資源上的應用作為研究對象，通過對分子標記技術的概述，進而對其在果蔬種質資源上的應用展開分析，以期為果樹種植奠定良好的基礎。

關鍵詞 分子標記技術;果樹種質資源;應用分析

中圖分類號：Q75 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.36.070

近年來，分子標記技術發展迅速，人們對于生物遺傳規律的認知也日漸加深。從1975年開始，人們開始通過DNA分子技術對生物進化、分類以及基因、遺傳建立等方面展開研究，直到1985年有學者提出了PCR技術，其實現了復雜DNA片段的體外擴增，憑借著迅速、準確以及高度靈敏等優勢受到生物界的重視，在品種鑒定、系譜分析、遺傳圖譜建立等領域廣泛使用。

1 分子標記技術類型

分子標記的類型較多，其按照分子生物學技術主要分成3種。1）在雜交技術基礎上提出的分子標記，其中代表性最強的就是RFLP技術。2）在PCR技術基礎上提出的分子標記技術，其主要分為RAPD、AFLP、SCAR等技術。3）在重復序列基礎上提出的分子標記技術，其中具有代表性的就是SSR、ISSR等技術。

2 分子標記技術在果樹種質資源上的應用

2.1 品種鑒定分類

果樹基本為多年木生植物、無性繁殖，不同地區栽培技術互相借鑒，使得更多物種產生，類型增多，如葡萄品種超過20 000種，但是實際計算發現其只有5 000～8 000種，果樹品種鑒定分類混亂成為當前果樹種質資源開發的一個重點問題。傳統的果樹品種鑒定分類主要是利用植物特征比較和細胞學、酶學等方面進行，但其無法準確區別材料關系相近的果樹。隨著科技的發展，分子標記技術的提出和應用使得果樹品種鑒定分類更加準確，其通過DNA多態性為我國果樹品種的鑒定分類起到了重要的推動作用。

自從RAPD技術在果樹品種鑒定中應用之后，其已成功地對蘋果、桃杏、草莓、柿子等多種果樹進行了具體的鑒定。例如，蘋果通過RAPD技術對“Fuji”品種的實木苗植株與芽變進行了區分，并沒有檢測檢測到兩者存在遺傳變異可能性。而在對楊梅等屬性的植物進行RAPD鑒定時，將中美區域不同品種的楊梅實現了具體區分，但是其在對楊梅品種進行分類時發現與RAPD結果不同，這需要進一步的完善楊梅分類方法[1]。在對地中海區域中的油橄欖進行分析之后發現17種油橄欖種質資源具有明顯的多態性，經聚類分析，17個品種分成大小兩類果群，其與形態學的分類是相同的[2]。

2.2 建立遺傳圖譜

建立遺傳圖譜是當前遺傳學研究領域的一種重要方向，其是對基因組展開系統研究和遺傳育種的重要依據，對于果蔬早期育種選擇具有重要的作用。傳統遺傳圖譜的建立是在形態、生理以及生化標記的基礎上建立起來的，由于其工作復雜，大部分的作物遺傳圖譜的建立不夠快。隨著分子標記技術的發展和應用，人們在建立果樹遺傳圖譜上也更加便捷，當前人們已經利用分子標記遺傳技術對蘋果、櫻桃、葡萄等果樹建立了遺傳圖譜。

Weeden等[3]利用RAPD和RFLP與同工酶分析建立了蘋果遺傳圖譜，蘋果品種圖譜標記構成共有253個，屬于24個連鎖群。King[4]建立了歐洲地區的蘋果遺傳圖譜，其標記了蘋果生長、果實性狀、抗寒抗病程度等基因性質。DIRLE等[5]將桃F2分離群體作為試驗材料，按照524個引物中所具備的38個多態引物擴增了8個連鎖群體。Cai[6]對柑橘雜交群體實行了RAPD分析，并與同工酶等方法共同建立了9個連鎖群體，將80%的基因組覆蓋完成。

遺傳圖譜的建立耗時時間長、投資多，彼此合作能夠推動深入研究，澳洲與歐洲共同建立的蘋果基因計劃，其通過建立與蘋果抗白粉、黑星、蚜蟲等病癥和果實品種、矮化等情況相關的遺傳圖譜。同時，英法等國家也建立了核果類基因計劃，通過RFLP、RAPD以及形態等位點建立了多個遺傳圖譜，標記了油桃、抗蚜蟲等病癥基因。

2.3 分析遺傳多樣性

遺傳多樣性是生命系統基本特征，其是物種自然進化發展的基礎。而分子標記技術作為種質資源遺傳多樣性檢測的工具，其在果樹種質資源檢測上的研究分為兩方面：1）篩選核心種質，也就是通過最小群體使最全面的遺傳信息保存下來;2）群體遺傳變異，是從分子方面對群體遺傳的多樣性展開了研究，通過RAPD技術分析了寬皮柑橘品種之間在高度遺傳上存在的多樣性，得到對其品種變化具有決定作用的就是有性雜交以及性狀重組這兩個因素。

Warburton ML等[7]利用RAPD技術對136個品種的桃子進行了遺傳多樣性分析，得到美國品種遺傳情況單一，亞洲品種遺傳多樣。張開春等[8]通過38個隨機引物對平邑甜茶展開了RAPD研究，得到了其中穩定的DNA條帶超過了170條，其中兩條為多態性譜帶，這就表示無融合生殖平邑甜茶的遺傳特征高度相同，遺傳分化表現較小。而Vicente等[9]通過RFLP技術以扁桃DNA為基礎對歐美品種的遺傳多樣性進行了分析，分析得到西班牙的品種遺傳多樣性不明顯。沈向[10]在對杏品種進行分析之后得到品種之間盡管存在地域差異，但是彼此之間的遺傳信息聯系十分密切，具有遺傳一致性表現。

2.4 標記基因

標記基因主要是將與目的基因聯系密切的篩選出來，其是基因克隆與分子育種的基礎。分子標記能夠使樣品DNA分子中的多樣差異被迅速找出來，進而將其與差異區的標記出來，進而確定目的基因定位區域。現階段，目的基因標記方法分為連鎖圖法、近等位基因系法和集群分離分析方法3種。但是，由于大部分的果樹在遺傳連鎖圖及其飽和度上缺乏，因此連鎖圖法的價值不足。近等位基因系方法需要7代以上才能夠使用，其使用具有一定的困難性。而集群分離分析方法則是將群體中的個體按照目的性狀不同而分成了兩組，各組個體DNA等量混合，建立了混合池，之后尋找基因組片段差異，標記連鎖型的基因，這是當前果樹基因標記的重要方法。

利用BSA方法對油桃和桃的雜交出的后代篩選出和果肉硬度等相關的RAPD標記。利用BSA以及RAPD技術篩選標記，同時將其標記在基因兩側，遺傳距離約為2 cm。而在對有毛、無毛以及白肉、黃肉等屬性的桃進行RAPD技術分析標記的時候，其連鎖距離分別為5 cm和9.5 cm。在分析海棠中找到了與蘋果中存在的抗黑星病的基因相關的標記，其中兩個標記基因連接的十分緊密，在對其進行克隆測試的時候，合成了特異序列引物，對其品種進行了抗性優化鑒定。研究結果表示，一般的無核果木無核性狀是由多基因所控制的，這些其有主效與微效兩種分別。將RAPD標記轉變成為了SCAR標記，在擴增SCAR引物擴增之后獲得的無核基因表達與攜帶者。

2.5 分析系譜

果木中的天然雜種較多，一些品種是由實生選育得到的，還有一些是由混合花粉雜交選育得到的。在無法判斷這類果木親本的時候，分子標記就能夠解決這種問題。蘋果品種津輕是在日本金冠基礎上得到的優良果木，其父本不清，可能為紅玉，在通過分子標記技術分析之后得到其與紅玉存在基因重疊現象，進而確認父本是紅玉、陸奧等三倍體品種，但是親本是二倍的，因此其體配子相對不清，之后在對其進行RAPD譜帶擴增分析的時候，得到二倍體配置母品種就是金冠，這與同工酶分析方法得到的結果是一樣的。溫州蜜柑栽培技術最早是在日本，但是栽培技術的起源是在中國，這是由RAPD技術得到的結果，而在對溫州蜜柑進行分析的時候發現其RAPD帶型和我國浙江的寬皮柑橘相似，但是與日本的立花橘存在較大的差異，這就表明溫州蜜柑和我國浙江寬皮柑橘關系更加接近。

3 結論

分子標記技術在果樹種質資源中的應用為人們從自然環境中獲取更多的資源提供了便利，同時也使得人們對自然資源的利用更加科學合理，其通過鑒定品種、建立遺傳圖譜等工作為果樹育種提供了便利，促使果樹育種速度提升，提高了培育效率，解決了果蔬育種周期問題，為果樹遺傳改良方面也作出了一定的貢獻。果木作為木生植物，其生長周期長，自交不親和，品種差異性較大，這就導致果樹遺傳群體及其作圖群體相對困難，進而對分子標記在果樹遺傳應用上受到影響，發展不夠完善。總體而言，標記多態性低是由于其提供的DNA水平信息無法滿足資源研究要求，遺傳圖譜飽和度不高，標記距離大，分子標記研究和育種實踐關系不親等。對此，我國需要加強國際之間的交流合作，對果樹生產中的問題結合起來，進行分子標記重點研究，篩選更多的多態性探針等，進行自動化的標記，進而使果樹的遺傳改良進程加快，為促進我國果木遺傳標記技術的發展奠定基礎。

參考文獻：

[1] 李好先.分子標記類型及其在石榴種質資源研究中的應用[A].中國園藝學會石榴分會籌備組.中國石榴研究進展（一）[C].中國園藝學會石榴分會籌備組：中國園藝學會，2010.

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[3] Weedn NF， Hammat M， Lawson DM， et al. Development and application of molecular marker linkage maps in woody fruit Crops[J]. Euphytica， 1994，（77）：71-75.

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[7] Warburton ML， Bliss F A. Genetic diversity in peach （Prunus persica L. Batch） revealed by randomly amplified polymor-phic DNA （RAPD） markers and compared to onbreeding confficients[J]. J. Amer.Soc.Hort.Sci.， 1996，121（6）：1012-1019.

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[9] Vicente MC， Truco MJ， Egea J， et al. RFLP variability in apricot （Pruns armeniaca L.）[J].Plant breeding，1998（117）：153-158.

[10] 沈向.用RAPD再探核果類果樹間親緣關系[J].西北農業大學學報，1999，27（4）：19-22.

（責任編輯：趙中正）