紫丁香苷抗腫瘤活性篩選及作用機(jī)制研究

秦湫紅　朱愛(ài)華

摘要 [目的]篩選對(duì)紫丁香苷較敏感的人腫瘤細(xì)胞系，研究其抗癌機(jī)理。[方法]采用四氮唑鹽法（MTT法）測(cè)定藥物的體外抑制作用，通過(guò)測(cè)定Caspase-3活性研究細(xì)胞凋亡通路在抗癌活性中的作用。[結(jié)果]在常見(jiàn)的15種人腫瘤細(xì)胞中，紫丁香苷的半數(shù)抑制濃度IC50低于100 μg/mL的有人肝癌細(xì)胞HepG2以及人前列腺癌細(xì)胞PC-3，紫丁香苷可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡因子Caspase-3活性增加。[結(jié)論]人肝癌細(xì)胞HepG2以及人前列腺癌細(xì)胞PC-3對(duì)紫丁香苷較為敏感，紫丁香苷的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴的特點(diǎn)；細(xì)胞凋亡途徑在紫丁香苷的抗腫瘤活性中起著一定的作用。

關(guān)鍵詞 紫丁香苷；抗腫瘤；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）14-0107-02

Study on the Screening and Mechanism of Syringin Anticancer Activity

QIN Qiuhong1，2，3， ZHU Aihua1，2，3

（1.Shaanxi New Drug Technology Development Center，Xian，Shaanxi 710075；2.Shaanxi Innovative Drug Research Center，Xian，Shaanxi 710025；3.Key Laboratory of Research and Revelopment of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine of Shaanxi Province，Xian，Shaanxi 710075）

Abstract [Objective]To screen human tumor cell lines sensitive to syringin， and study its anticancer mechanism. [Method]To determine the inhibitory effect of syringin in vitro using tetrazolium salt （MTT） assay， and study the role of apoptosis pathway by assay of Caspase3 activity. [Result]Among the 15 common human tumor cell lines， syringin IC50 of hepatoma cell HepG2 and prostate cancer cell PC3 were below 100 μg/mL. Syringin can promote the activity of Caspase3 in tumor cells. [Conclusion] Hepatoma cell HepG2 and prostate cancer cell PC3 are more sensitive to syringin， and the inhibition of syringin presents a dosedependent manner. The cell apoptosis pathway plays a role in the anticancer activity of syringin.

Key words Syringin；Anticancer；Cell apoptosis

紫丁香苷（syringin）是從五加科和木犀科根莖中提取分離得到的一種典型的酚苷類化合物。從其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，紫丁香苷的苷元為芥子醇，其衍生物屬于苯丙醇類物質(zhì)，具有抗氧化活性。臨床研究顯示紫丁香苷可能具有多種藥用功能[1]，例如增強(qiáng)免疫力[2]、降血脂[3]、抗氧化[4]、抗抑郁[5]、防止心肌缺血[6]、抗炎鎮(zhèn)痛[7]、抗高血糖[8]、抗抑郁[9]、抗腫瘤活性[10]及保肝作用[11] 等，具有良好的藥用價(jià)值與開(kāi)發(fā)前景。對(duì)含有紫丁香苷成分的中藥材祖師麻、救必應(yīng)、木蘭屬植物、丁香屬植物以及刺五加等的抗腫瘤活性的研究報(bào)道顯示紫丁香苷可能是這些天然藥物的抗腫瘤活性成分。目前針對(duì)紫丁香苷抗癌活性的研究較少，其抗腫瘤的藥效學(xué)并不明確[12]。筆者對(duì)倒卵葉五加中提取分離的紫丁香苷的抗腫瘤作用進(jìn)行了系統(tǒng)性篩選，針對(duì)較敏感的細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路進(jìn)行了測(cè)定，以探究其抗腫瘤作用是否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑得以實(shí)現(xiàn)，以期為紫丁香苷的藥學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品

紫丁香苷（陜西中藥研究所提供）；氟尿嘧啶注射液[上海旭東海普藥業(yè)有限公司（批號(hào)FA161208）]；RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)GE公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜（昊科生物工程有限責(zé)任公司）；MTT（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectramax Plus 384酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；11231BBC86生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；WJ-2 CO2培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；XD-202倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1

細(xì)胞株及培養(yǎng)條件。試驗(yàn)所用細(xì)胞株均購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，根據(jù)各細(xì)胞株最適培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)傳代。

1.3.2 體外抗腫瘤活性測(cè)定。分別取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋成約20 000個(gè)細(xì)胞/mL，96孔板中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入設(shè)定濃度的受試藥物，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄上清，每孔加入200 μL新鮮配制的含有0.2 mg/mL MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，并加入200 μL DMSO，輕微振蕩后測(cè)定參考波長(zhǎng)450 nm、檢測(cè)波長(zhǎng) 570 nm下的光吸收值（OD值）；或取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基細(xì)胞，96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每孔加入設(shè)定濃度的受試藥物，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，加入三聯(lián)液（10%SDS，5%異丁醇，0.012 mol/L HCl）100 μL，于37 ℃過(guò)夜后測(cè)定570 nm光吸收值（OD值）。按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

生長(zhǎng)抑制率= （1-用藥組OD值/對(duì)照組OD值）×100%

以同一樣品的不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖可得到劑量反映曲線，從中求出樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.3

Caspase-3活性測(cè)定。培養(yǎng)細(xì)胞以PBS緩沖液快速漂洗2次，加入細(xì)胞裂解液100 μL，并加入濃度為1 mg/mL的Caspase-3酶作用底物Ac-DEVD-AMC 5 μL，用PBS緩沖液加到200 μL，在37 ℃孵育60 min，置于分光光度計(jì)下檢測(cè)OD440光吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫丁香苷對(duì)15株人腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性篩選

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，紫丁香苷對(duì)15種人腫瘤細(xì)胞具有不同程度的抑制作用。由表1可知，紫丁香苷對(duì)15種人腫瘤細(xì)胞的體外半數(shù)抑制濃度IC50為40.13～382.15 μg/mL。其中，紫丁香苷體外抑制作用較強(qiáng)的是人肝癌細(xì)胞HepG2以及人前列腺癌細(xì)胞PC-3，IC50分別為40.13、88.08 μg/mL。

從表2可以看出，不同濃度的紫丁香苷對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2以及人前列腺癌細(xì)胞PC-3的生長(zhǎng)抑制率均隨著藥物濃度升高而升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

2.2 細(xì)胞凋亡在紫丁香苷抗腫瘤活性中的作用

針對(duì)對(duì)紫丁香苷較為敏感的人肝癌細(xì)胞HepG2以及人前列腺癌細(xì)胞PC-3，對(duì)其用藥后的細(xì)胞凋亡因子Caspase-3相對(duì)活性進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)測(cè)得的OD440與存活率之間的比值得到細(xì)胞凋亡因子Caspase-3的相對(duì)活性。由表3可知，人肝癌細(xì)胞HepG2以及人前列腺癌細(xì)胞PC-3的細(xì)胞凋亡因子Caspase-3相對(duì)活性均會(huì)隨著紫丁香苷的濃度增大而升高。該結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路很可能在紫丁香苷的抗腫瘤活性中起著一定的作用。

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)紫丁香苷抗腫瘤活性的研究非常少，且還沒(méi)有研究涉及該藥對(duì)不同腫瘤活性研究的系統(tǒng)性評(píng)價(jià)，紫丁香苷抗腫瘤活性的藥效學(xué)并不明確。在該研究中，采用抗腫瘤藥物篩選常用的MTT法，以氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)常見(jiàn)的15種人腫瘤細(xì)胞類型的紫丁香苷抗腫瘤活性進(jìn)行探究和評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫丁香苷對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2以及人前列腺癌細(xì)胞PC-3具有明顯的抗腫瘤活性，IC50分別為40.13、88.08 μg/mL，且均呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。根據(jù)紫丁香苷的芥子醇結(jié)構(gòu)分析，其很可能具有抗氧化活性，可以有效地抵御或減少自由基的傷害，減少腫瘤誘導(dǎo)的發(fā)生。目前已有研究報(bào)道紫丁香苷有保肝護(hù)肝的功效[11]，這與該研究的抗肝癌細(xì)胞活性結(jié)果相一致。

通過(guò)測(cè)定用藥后的細(xì)胞凋亡因子Caspase-3的相對(duì)活性，發(fā)現(xiàn)紫丁香苷可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，因此，細(xì)胞凋亡很可能在紫丁香苷抗腫瘤活性中起著一定的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳日道，鄒建華，賈景明，等.天山雪蓮懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中紫丁香苷的分離及含量測(cè)定[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（4）：436-439.

[2] 張勇.紫丁香甙的測(cè)定及其降血脂、增強(qiáng)免疫力的研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2004：1-53.

[3] NIU H S，HSU F L，LIUC I M.Role of sympathetic tone in the loss of syringininduced plasma glucose lowering action in conscious wistar rats[J].Neurosci Lett，2008，445（1）：113-116.