豬偽狂犬病毒流行株JL1株主要基因的遺傳變異分析

張姍姍，冷 雪，時 坤，李健明，宮慶龍，劉 藝，孫志博，劉亞東，杜 銳

(吉林農業大學,長春 130118)

豬偽狂犬病毒(Porcine Pseudorabies Virus，PRV)是豬偽狂犬病病原體[1]，可引起新生仔豬的致命感染、育肥豬呼吸道癥狀和母豬繁殖障礙，給養豬業造成嚴重經濟影響[2]。PRV的一些主要糖蛋白參與病毒復制和傳播，其中gE和gI基因是PRV增殖的非必需蛋白，同時具有協同控制毒力的功能，gE基因還可作為鑒別野毒感染和疫苗免疫的重要蛋白[3-5]。gD和gB糖蛋白是病毒復制所必需的糖蛋白，同時也是PRV重要的免疫原性蛋白，誘導機體產生中和抗體和細胞免疫反應[6-7]。TK基因(胸苷激酶)是PRV的非必需和主要的毒力基因，對病毒在中樞神經系統中的復制起重要作用[8]。

自2012年以來，中國許多Bartha-K61疫苗免疫豬場再次爆發豬偽狂犬病，特別是在豬群密集地區廣泛傳播。在我國多個省份的豬偽狂犬病疫苗免疫豬場的發病率和死亡率呈不斷上升趨勢，研究表明一些重要的糖蛋白在多個方面有一定程度的變異，出現了新的發病特征，存在毒力增強的情況，疫情更加難以控制，給養豬業構成了嚴重的經濟負擔。為了解吉林省某地區分離的PRV JL1株的遺傳變異情況，對其主要基因進行克隆測序及遺傳變異分析，以期為今后吉林省PRV新型疫苗的研制和豬偽狂犬病的預防和凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與試劑 PRV JL1流行毒株，實驗室保存；大腸桿菌JM109感受態細胞，pMD18-T Vector，Ex Taq DNA聚合酶，PrimeSTAR HS DNA Polymerase，Marker DL2000，250 bp DNA Ladder均購自TaKaRa公司；DNA Virus Kit購自OMGEA公司；凝膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒購自Oxygen公司。

1.1.2 引物設計與合成 按照GenBank登錄號為BK001744中的PRV TK、gD、gI、gE和gB全基因序列設計5對特異性引物(表1)，擴增目的片段大小分別為963、1101、1203、1734和2742 bp。引物均由庫美生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Tab 1 The sequences of primers

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組DNA提取及PCR擴增 按照OMGEA公司的Viral DNA Kit說明書提取DNA，并以提取的PRV基因組DNA為模板，對實驗室保存的JL1毒株的TK、gI、gD、gE和gB基因分別進行PCR擴增，反應體系為：Ex Taq酶0.25 μL，GC bufferⅠ12.5 μL,dNTP 4 μL,DNA模板2 μL,上、下游引物各0.5 μL，DEPC水補足于25 μL。PrimeSTAR HS DNA Polymerase 25 μL,GC buffer 12.5 μL ,dNTP 2 μL,DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，DEPC水補足于25 μL。TK、gD、gI基因的PCR反應程序：95 ℃預變性5 min,94 ℃變性45 s，59 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。gE、gB基因PCR反應程序：98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 40 s/2 min 40 s，30個循環。反應結束，取3～5 μL PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并觀察其目的條帶大小。將剩余PCR產物送生工生物公司進行測序鑒定。

1.2.2 目的基因克隆測序 用DNA凝膠回收試劑盒純化回收目的片段，并與pMD18-T克隆載體于16 ℃下連接過夜，次日轉入大腸桿菌感受態細胞JM109中，涂布于含氨芐青霉素(終濃度為100 μL/mL)的LB平板上，37 ℃培養12～16 h。經藍白斑篩選后，挑取單個菌落于6 mL含氨芐青霉素(終濃度為100 μL/mL)的LB液體培養基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養12～16 h。經PCR鑒定正確的陽性質粒送上海生工生物公司進行測序。

1.2.3 遺傳變異分析 利用DNASTAR MegAlign軟件將PRV JL1毒株與GenBank數據庫中具有代表性的參考毒株(表2)序列進行核苷酸及氨基酸同源性分析以及多序列比對分析，再利用Mega6.0軟件的鄰近法構建遺傳進化樹。

表2 序列分析用PRV參考毒株Tab 2 PRV reference strains for sequence analysis

2 結果與分析

2.1 PRV TK、gI、gD、gE和gB基因的PCR鑒定 以提取的PRV JL1株DNA為模板，使用TK、gI、gD、gE和gB基因特異性引物進行的PCR擴增，結果如圖1所示，TK基因約963 bp、gI基因約1101 bp、gD基因約1203 bp、gE基因約1734 bp、gB基因約2742 bp，結果出現與目的條帶預期結果一致的條帶。

M1. Marker DL 2000；1-5. JL1株TK,gI,gD,gE和gB基因擴增產物; M2. 250 bp DNA LadderM. Marker DL 2000；1-5. TK,gI,gD,gE and gB gene PCR amplification product of JL1 strain; M2. 250 bp DNA Ladder圖1 JL1株TK,gI,gD,gE和gB 基因PCR鑒定Fig 1 PCR amplification of PRV TK,gI,gD,gE and gB gene from JL1 strain

2.2 TK、gI、gD、gE和gB基因的序列分析

2.2.1 同源性分析 核苷酸和氨基酸同源性比對結果顯示，JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因與2012年以后國內分離的流行毒株如BJ/YT、JS-2012、TJ、HeN1等PRV變異株的核苷酸同源性為99.7%～100%；其氨基酸同源性為99%～100%。與國內經典毒株(如Ea、Fa和SC)的核苷酸同源性為99.3%～100%；其氨基酸同源性為98.9%～100%。與國外毒株(如Bartha、Becker、Kaplan)的核苷酸同源性為96.4%～99.7%；其氨基酸同源性為94.3%～99.7%(表3-表7)。

結果表明，PRV JL1株與國內新流行變異毒株同源性較高, 與國內早期經典毒株次之, 而與國外經典毒株同源性較低。

表3 PRV JL1株TK基因的核苷酸及推導的氨基酸序列同源性比較Tab 3 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of TK gene of PRV JL1 strain

右上角為核苷酸的同源性比較，左下角為氨基酸同源性比較(表4-表7同)

表4 PRV JL1株gI基因的核苷酸及推導的氨基酸序列同源性比較Tab 4 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gI gene of PRV JL1 strain

表5 PRV JL1株gD基因的核苷酸及推導的氨基酸序列同源性比較Tab 5 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gD gene of PRV JL1 strain

表6 PRV JL1株gE基因的核苷酸及推導的氨基酸序列同源性比較Tab 6 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gE gene of PRV JL1 strain

表7 PRV JL1株gB基因的核苷酸及推導的氨基酸序列同源性比較Tab 7 The nucleotide and deduced amino acid sequence homology of gB gene of PRV JL1 strain

續表

2.2.2 多序列比對分析 通過對JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因進行氨基酸多序列比對分析，結果顯示，與國外經典毒株Kaplan比較,TK基因有1個氨基酸發生突變，與Bartha-K61相比有2個氨基酸發生突變，與國內近年來里流行株JS-2012株相比沒有氨基酸發生突變，TK基因較為保守。與國外毒株Kaplan和Bartha比較,gD基因在第278位和279位插入兩個氨基酸，即精氨酸(R)和脯氨酸(P),同時有8個氨基酸發生突變，與國內流行株JS-2012毒株具有相同的氨基酸插入和缺失。與國外經典毒株Kaplan比較，gI基因在第172位缺失一個組氨酸(H)，第238位插入一個甘氨酸(G)，gI基因這兩處發生的缺失和插入與國內流行株JS-2012毒株相同，此外還發現19個氨基酸發生點突變。與國外經典毒株Kaplan比較，gE基因在第48位插入一個天冬氨酸(D),第496位插入一個天冬氨酸(D),gE基因這兩處的插入與國內新流行株JS-2012株具有相同氨基酸插入，該位置發生的變異與國內報道的流行毒株變異特征相一致,此外還有16個氨基酸發生突變。與國外毒株Bartha、Kaplan相比,gB基因在第75～77位缺失3個氨基酸，即絲氨酸(S),脯氨酸(P)和甘氨酸(G),在第94位插入一個甘氨酸(G),gB基因這兩處發生的缺失和插入與國內新流行株JS-2012毒株相同,另外在119～122位插入4個氨基酸(AAVR),gB基因該處發生的插入與德國分離的DUL34gfp毒株具有相同插入，此外還有20個氨基酸發生突變，該gB基因多處位置發生較大的變異，可能導致其抗原性發生變化。以上多序列比對結果表明，除去部分氨基酸變異，JL1株的變異與JS-2012株相同。

2.2.3 遺傳進化分析 如圖2所示，將JL1株TK、gI、gD、gE和gB主要基因與GeneBank上其他參考毒株進行遺傳進化樹分析，PRV根據不同國家分離的毒株可分為2個基因型，歐美毒株屬于GⅠ型，而國內毒株屬于GⅡ型。TK基因遺傳進化樹結果如圖2A所示，PRV JL1毒株與中國新流行毒株處于一個分支(除了SC株)，尤以與LY、YY和BJ/YT新流行毒株遺傳關系較近，而與國外歐美毒株遺傳關系相對較遠。gI基因遺傳進化樹結果如圖2B所示，PRV JL1株與國內2012年分離的HeN1變異毒株處于一個相對獨立的小分支，遺傳關系較近，而與歐美毒株處于不同的分支，遺傳關系相對較遠。gD基因遺傳進化樹結果顯示，歐美毒株中Becker和NIA3毒株又處于一個獨立的小分支；中國毒株又可根據分離的年代不同分為A和B兩個亞型，A型包括PRV JL1株和國內2012年以后分離的新型變異毒株，B型包括國內早期經典毒株；由圖2C可見，JL1毒株與中國新流行變異毒株遺傳關系較近，而與歐美毒株處于不同的分支，遺傳關系相對較遠。gE基因遺傳進化樹結果顯示，國外毒株Becker和NIA3毒株又處于一個小分支；中國毒株又可根據其分離的年代不同分為A和B兩個亞型，PRV JL1株與國內2012年以后分離的新型變異毒株屬于A亞型，而國內早期經典毒株屬于B亞型；由圖2D可見，PRV JL1株與中國新流行毒株BJ/YT和TJ變異毒株遺傳關系較近，而與歐美毒株處于不同的分支，遺傳關系相對較遠。gB基因遺傳進化樹結果顯示如圖2E所示，PRV JL1株與國內2012年以后分離的變異毒株遺傳關系較近，而與歐美毒株處于不同的分支，遺傳關系相對較遠。

圖2 JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因系統進化樹分析圖Fig 2 Phylogenetic tree analysis forTK(A),gI(B),gD(C),gE(D),gB(E) genes of PRV JL1 strain

3 討 論

2012年以來，新型豬偽狂犬病已經發生在中國大部分Bartha-K61疫苗免疫豬場。由于新型的PRV變異株的出現導致中國豬場感染PRV局勢日益惡化，對養豬業造成巨大的影響。研究報道[9-11]表明，這些新出現的PRV變異株的致病性高于以前PRV分離株，其免疫原性也不同于Bartha-K61疫苗，造成傳統疫苗不能對變異株提供有效的免疫保護。不同毒株遺傳進化分析表明，PRV可根據區域的不同劃分為2種不同的基因類型，中國分離株屬于基因II型，歐美國家分離株屬于基因I型。這些新爆發的PRV變異毒株之間的親緣關系較近而與歐美國家分離的Bartha株遺傳關系較遠，這可能也解釋了PRV再次出現在Bartha-K61疫苗免疫豬場的原因。另外，中國近幾年分離的PRV變異株與以前分離株相比，新流行毒株在基因和蛋白水平上發生了變異，進而導致現有疫苗保護率降低，疫病難以防控，這些基因變異可能也是導致傳統豬偽狂犬病疫苗接種失敗的一個關鍵因素。

為更好了解吉林省某地區PRV流行及遺傳變異情況，對PRV JL1株TK、gD、gI、gE和gB基因進行了克隆測序，與Genbank上已發表參考毒株在核苷酸和氨基酸水平上進行同源性比對和多序列比對分析，并繪制了遺傳進化樹。其中核苷酸和氨基酸同源性比對表明，PRV JL1毒株與國內近幾年新流行PRV毒株在核苷酸和氨基酸水平上同源性較高，而與國外經典毒株同源性較低。遺傳進化樹分析表明，PRV JL1株與中國近年來不同地區分離的新型PRV變異株遺傳關系密切相關，而與國外經典毒株遺傳關系較遠，表明JL1毒株屬于中國PRV新流行的變異毒株。氨基酸多序列比對表明，與GenBank中其他的參考毒株相比，PRV JL1毒株表現了廣泛的變化，包括在大多數病毒蛋白發生替換、插入和或缺失。其gD基因在第278位和279位插入兩個氨基酸(RP)，gI基因在第172位缺失一個組氨酸(H)和第238位插入一個甘氨酸(G)，gE基因在第48位和第496位各插入一個天冬氨酸(D)，gE基因該兩處的插入為近幾年PRV變異株特征變異位點，該位置發生的變異與國內范克偉[12]和Fan[13]報道的流行毒株變異特征相一致,這也表明該JL1毒株屬于我國近幾年的新流行毒株。gB基因在第75～77位缺失3個氨基酸(SPG)，第94位插入一個甘氨酸(G)，另外在119～122位插入4個氨基酸(AAVR)，gB基因該處發生的插入與德國分離的DUL34gfp毒株具有相同插入。因此，PRV JL1株重要基因的變異可能導致PRV毒力和抗原性發生變化。

總而言之，通過對PRV JL1毒株重要基因(TK、gI、gD、gE、gB)的遺傳變異分析表明PRV JL1毒株不同于以前的分離株，具有PRV新流行變異株獨特的變異特征。但這些氨基酸殘基的變異對PRV變異株毒力及免疫原性的影響是否是導致中國近幾年豬群PRV廣泛流行的原因有待進一步研究。

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