血清miR—499a—3p在不穩(wěn)定型心絞痛中的表達(dá)

陳英 曾志羽 鄭慧蕾 文宏 龔丹萍

【摘 要】目的：檢測miR-499a-3p在不穩(wěn)定型心絞痛（Unstable angina，UA）與疑似心絞痛非冠心病患者血清中的表達(dá)差異。方法：收集實驗組UA患者（n=30）及對照組疑似心絞痛的非冠心病患者（n=21）外周血。利用HiPure Serum/Plasma miRNA Kit分離方法，獲取血清中總RNA。Real-Time PCR檢測兩組血清miR-499a-3p表達(dá)量。結(jié)果：通過相對定量分析2-△△Ct法算出兩組miR-499a-3p的相對表達(dá)量，使用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件分析，與對照組相比較，UA組血清miR-499a-3p的表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。結(jié)論：實驗組較對照組血清miR-499a-3p的表達(dá)水平增高，可為UA的有效檢測指標(biāo)提供新的策略。

【關(guān)鍵詞】UA； miR-499a-3p； cel-mir-39

【中圖分類號】R395.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）04-00-02

前言

CHD包括隱匿型或無癥狀性冠心病、心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、猝死五型。曾有多項研究表明，miR-499在心肌細(xì)胞中富集，當(dāng)發(fā)生急性心肌梗死時，血清miR-499呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[1-3]。冠脈不穩(wěn)定斑塊破裂是急性心肌梗死的常見原因。目前國內(nèi)外關(guān)于UA循環(huán)miRNA的研究相對較少，UA缺乏快速、有效的檢測指標(biāo)，所以探索UA患者循環(huán)miRNA表達(dá)差異意義重大。本文旨在探究miR-499a-3p與UA的關(guān)系，為血清miR-499a-3p作為早期診斷UA的潛在生物標(biāo)記物提供依據(jù)，避免因冠脈不穩(wěn)定斑塊破裂、糜爛基礎(chǔ)上繼發(fā)血栓形成導(dǎo)致冠狀動脈持續(xù)、完全閉塞。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：血清miRNA提取試劑盒、miRNA第一鏈cDNA合成、通用型SYBR GREEN I定量PCR試劑盒、焦磷酸二乙酯（DEPC）、Rnase free water。

1.1.2. 耗材：一次性吸頭、0.2ml平蓋磨砂PCR管、1.5mlEP管、0.2ml平蓋透明八聯(lián)PCR管。

1.1.3 儀器： 顆粒制冰機、高速冷凍離心機、快速震蕩混勻器、PCR儀、定量PCR儀。

1.1.4.實驗對象：30名患者冠脈造影證實血管狹窄≥50%，同時滿足2012年不穩(wěn)定心絞痛（UA）/非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）患者管理指南作為實驗組。21名患者因心前區(qū)或胸骨后疼痛行冠脈造影且結(jié)果為陰性作為對照組。

2 方法

2.1 血清的收集和儲存：將采取的5ml外周靜脈血樣收集在促凝管中并在4℃下靜置10分鐘。將樣品在4℃以2500r/min離心5分鐘以獲得上清液。用移液槍取1ml血清加入到1.5ml離心管，最后放入-80℃低溫冰箱保存直至使用。

2.2 血清miRNA 提取：取500ul的血清，加入25fmol/μl的cel-mir-39外參照（購自ABI公司）10μl后，按照說明書提取miRNA，總RNA（含小分子RNA）樣品保存-80?C冰箱。

2.3 莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：cel-miR-39：

5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcaagct -3miR-499a-3p：

5- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACagcaca -3

逆轉(zhuǎn)錄步驟和體系按說明書進(jìn)行。

2.4 熒光定量PCR：cel-miR-39上游引物GGCCTCACCGGGTGTAAATCAG；miR-499a-3p上游引物GGCCAACATCACAGCAAGTCTG；通用下游引物AGTGCAGGGTCCGAGGTAT。反應(yīng)體系：Mix10ul；上/下游引物0.6ul； cDNA1ul；雙蒸水7.8ul。反應(yīng)條件：95℃ 10min； 95℃ 15s； 60℃ 1min反應(yīng)結(jié)束后，按儀器默認(rèn)條件40個循環(huán)、60℃收集熒光。樣本相對表達(dá)量的計算：按以上體系以及條件分別測定待測樣本目的基因及外參的Ct值。2-△△Ct法計算基因表達(dá)的差異。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用spss25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示，兩組間采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間采用2檢驗；若p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

不穩(wěn)定型心絞痛患者血清miR-499a-3p表達(dá)水平

3.1 兩組miR-499a-3p相對表達(dá)量和年齡情況

3.2 兩組性別、民族、高血壓、糖尿病、血脂異常情況

上表進(jìn)行組間四格表卡方檢驗： 2性別 =0.264，P=0.607；2民族=2.596，P=0.107；2高血壓=1.244，P=0.265；2糖尿病=0.400，P=0.527；2血脂異常=0.415，P=0.520。結(jié)合1、2可以看出血清miR-499a-3p在兩組患者表達(dá)存在差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而性別、年齡、民族、高血壓、糖尿病、血脂異常進(jìn)行統(tǒng)計分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

4 討論

UA是CHD的一種常見類型；彌漫性動脈粥樣硬化導(dǎo)致嚴(yán)重的胸痛，持續(xù)時間較長，易于惡化為急性心肌梗死（AMI）或猝死[4]。目前臨床上缺乏快速、有效的生物標(biāo)志物。近年來，miRNA作為生物標(biāo)志物的研究已成為熱點。

循環(huán)mirRNA是具有內(nèi)源性核糖核酸酶活性的短RNA并在人體血清內(nèi)呈穩(wěn)定形式存在[5]。miRNA是一組長度為21-25個核苷酸組成的小型非編碼RNA[6]。幾項研究強調(diào)了循環(huán)miRNA作為急性冠脈綜合征（ACS）診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力[7-10]。miRNA表達(dá)譜分析研究表明特定的miRNA在患病心臟中的表達(dá)水平發(fā)生變化，表明它們參與了心肌病[11，12]。基于miRNA的組織選擇性，心肌細(xì)胞富含miRNA（諸如miR-1，miR208a，miR-208b，miR-133a），并已經(jīng)提出miR-133b和miR-499作為急性心肌梗死患者潛在的診斷標(biāo)志物[13-15]。

與cTnI和CK-MB相比，miR-499早在胸痛發(fā)作后1小時就存在于血漿中，甚至在胸痛發(fā)作后9小時仍繼續(xù)增加，而CK-MB和cTnI需要在胸痛2小時后才能檢測到，表明 miR-499水平可用于早期檢測AMI，這支持了miR-499可能作為AMI的早期生物標(biāo)志物的證據(jù)[3]。以上發(fā)現(xiàn)為血清miRNA-499a-3p作為潛在生物標(biāo)志物用于輔助診斷 UA提供了實驗依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)UA組血清miRNA-499a-3p 升高，這是支持血清miRNA-499a-3p作為UA的早期生物標(biāo)志物的證據(jù)，能夠早期診斷UA加以藥物、手術(shù)等干預(yù)措施，減少UA進(jìn)一步發(fā)展為AMI。但是考慮到樣本量不是十分充足，血清miRNA-499a-3p作為潛在生物標(biāo)志物用于UA臨床診斷的價值尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究分析不穩(wěn)定型心絞痛與疑似心絞痛的非冠心病患者血清miR-499a-3p的表達(dá)差異，為血清miR-499a-3p作為潛在生物標(biāo)志物用于臨床輔助診斷UA提供了一種新的策略。

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