大鼠少突膠質細胞體外培養方法

孟贊 唐櫟

摘 要： 目的：體外培養高純度的少突膠質細胞。方法：取SD乳鼠腦皮質，用增殖培養基聯合EDTA消化機械吹打分離純化法培養純化；光學顯微鏡觀察細胞形態；純化培養3d后免疫熒光染色鑒定細胞類型。結果：獲得高純度的少突膠質前體細胞以及成熟的少突膠質細胞，少突膠質前體細胞免疫熒光A2B5標記陽性，成熟少突膠質細胞免疫熒光MBP標記陽性。結論：用增殖培養基聯合EDTA消化機械吹打分離純化法可以得到高純度的少突膠質前體細胞以及成熟少突膠質細胞。

關鍵詞： 少突膠質細胞；原代培養；細胞增殖；EDTA

少突膠質細胞（oligodendrocytes， OLs）是中樞神經系統中膠質細胞的[1]。少突膠質細胞由少突膠質前體細胞 （oligodendrocyte progenitor cells， OPCs）分化成熟而來，少突膠質細胞生長發育的損傷可致脫髓鞘疾病導致神經系統損傷[2]，因此研究少突膠質細胞的損傷機制，促進少突膠質細胞修復是我們的目標。所以得一種簡單高效的培養少突膠質細胞的方法具有重要的意義。本實驗在傳統的培養方法的基礎上，對細胞增殖和分離純化等相應步驟進行了適當改進，簡化了實驗操作步驟，節約了實驗成本，成功獲取了大量的少突膠質細胞，為研究少突膠質細胞的損傷的其分子機制奠定基礎。

材料和方法

1 材料 清潔級出生0～3d SD乳鼠，雌雄不限，動物飼養環境為清潔級，實驗過程對動物的處置符合相關動物倫理學要求，B104神經母細胞瘤細胞株，DMEM/F12，胎牛血清，胰酶，多聚賴氨酸（PDL），小 鼠 抗 A2B5 抗體，羊抗小鼠髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）等。

2 方法

2.1 B104CM的收集和存儲 B104細胞在20ml （DMEM/F12+10%FBS）培養基，75cm2的培養瓶 中常規培養，細胞80%～90%融合時，棄去廢液，加入10 ml（DMEM/F12 + 1% N2 supplement） 培養液，4d后收集上清液備用。

2.2 少突膠質細胞原代培養及分離純化 取SD乳鼠，冰埋麻醉1～5 min，體積分數75%乙醇消毒，無菌下取出大腦皮質，解剖顯微鏡下剝離腦膜，取腦皮質切成1mm2小塊，放入離心管中，加入PBS后用吸管輕輕反復吹打制成細胞懸液，種植于直徑10cm由PDL包被的培養皿內（每只乳鼠的細胞接種于一個培養皿內）入孵箱常規培養5d，培養液為（DMEM/F12+10% FBS），隔天換液。培養5天后，B104CM（DMEM/F12+20%B104CM+1%N2 supplement）增殖3d后， EDTA消化機械吹打分離純化法（EDTA消化10 min，適當力度吹打，使 OPC從星型膠質細胞上脫落） 分離和純化 OPC。

2.3微鏡觀察 倒置顯微鏡觀察細胞形態并采圖。

2.4細胞免疫熒光染色OPC以3 ×107 /ml 的密度種植在兩個24孔板中（每孔底部放置孔徑相同的載玻片）分別培養1d和分化培養3d，PBS清洗，含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（PBS）固定30min，山羊血清37℃封閉30min，加一抗，OPC加小鼠抗A2B5IgG （ 1：100） 標記，分化培養的少突膠質細胞加羊抗MBP IgG （ 1：100） 標記，4℃過夜，加抗羊IgG（ 1：500） ，濕盒內37℃孵育30 min，PI （ 1：1000） 染核30s，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下采集圖片。A2B5 標記陽性的為OPC，MBP標記陽性的為成熟的少突膠質細胞。

結 果

1 神經膠質細胞生長情況

混合培養5d，可見兩種形態不同的細胞。多數細胞體積較大，緊貼瓶底生長，呈扁平狀有較粗大突起，胞核較大，呈圓形。位于扁平細胞的表面可見一些體積小，胞體呈圓形或橢圓形，強折光性強，具有單極或雙極的細小突起的細胞。培養第8d，在倒置顯微鏡下觀察，胞體扁平、突起粗大的細胞已長滿瓶底，細胞完全融合，小圓形或橢圓形、強折光性強，具 有單極或雙極的細胞位于上層。純化后培養1d的OPC胞體成橢圓型，折光性強，有單極或雙極的細小突起。分化培養的細胞（第12 d）胞體逐漸由橢圓形變為圓形或不規則形， 細胞突起增多，培養至第14 d，次極細胞突起分支增 多，常交互形成“蜘蛛網”樣，極為茂 密，分化為成熟的少突膠質細胞。

2 少突膠質細胞免疫熒光鑒定和觀察

OPC特異性抗原A2B5陽性細胞占細胞總數95%以上，綠色熒光染色信號位于細胞膜OL特異性抗原MBP陽性，細胞占細胞總數95%以上，綠色熒光染色信號位于胞膜； OPC胞體呈橢圓形，具有典型的雙極細小突起，綠色熒光標記的特異性抗原A2B5位于胞體和突起上。OL胞體為圓形，細胞突起多，次極細胞突起交互成網樣，綠色熒光染色信號位于胞體和突起上。

原代培養神經細胞作為一種相對簡化的模型， 生長發育特征與體內相似，且樣本純度高，實驗條件比較恒定且可控，在闡明許多少突膠質細胞退化所致神經退行性疾病的細胞及分子機制方面有著不可替代的作用。本實驗節約實驗成本，簡化培養步驟，獲得了大量的少突膠質細胞，這對于以原代培養少突膠質細胞作為實驗對象的研究而言尤為重要。A2B5是少突膠質前體細胞特異性標記物， MBP 是成熟少突膠質細胞特異性標記物，本實驗利用上述兩個蛋白與細胞核共同染色，對培養的細胞性質做鑒定及細胞純度進行分析，證明細胞培養成 功，細胞純度可以達到 95%以上。

參考文獻

[1]龍彩瑕，李俊發.中樞神經系統退行性疾病研究概述[J].基礎醫學與臨床，2005，25： 673-678.

[2]Tang Y，Nyengaard JR，Pakkenberg B，et al. Age-induced white matter changes in the human brain： a stereological investigation[J].Neurobiol Aging，1997，18： 609-615.