亞抑菌濃度抗菌藥物對多重耐藥鮑曼不動桿菌生物膜形成的影響

樊莉 孫鳳軍 枉前 夏培元 周世文

摘 要 目的：探討亞抑菌濃度（sub-MIC）抗菌藥物對多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDR-AB）生物膜形成的影響，為臨床相關感染的防治提供參考。方法：采用瓊脂平板倍比稀釋法測定臨床分離鮑曼不動桿菌（AB）的最低抑菌濃度（MIC），篩選MDR-AB菌株；采用微孔法分析不同劑量sub-MIC抗菌藥物對MDR-AB菌株生物膜形成的影響，并使用AB標準菌株（ATCC 17978）進行驗證；采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應法測定其生物膜形成相關調控基因的表達情況。結果：臨床檢出的MDR-AB菌株對碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類抗菌藥物耐藥（MIC≥16 μg/mL），對多黏菌素B和替加環素較敏感（MIC≤8 μg/mL）。不同劑量sub-MIC頭孢吡肟、環丙沙星、阿奇霉素、阿米卡星均可顯著抑制大多數MDR-AB菌株生物膜的形成，且以阿奇霉素的抑制作用相對最強（其對應菌株的相對生物膜形成值最小）；多西環素可顯著誘導大多數菌株生物膜的形成，而美羅培南、頭孢哌酮、替加環素、慶大霉素、多黏菌素B對其生物膜形成的影響并不明顯。驗證試驗結果顯示，與未經藥物作用的對照菌株比較，經0.25、0.125 μg/mL阿奇霉素以及0.25 μg/mL阿米卡星作用后，標準菌株的相對生物膜形成值均顯著下降（P<0.05），且阿奇霉素的抑制作用呈現一定的量效關系（P<0.05）。基因表達測定結果顯示，與未經藥物作用的對照菌株比較，經0.25 μg/mL阿奇霉素作用后，bap、filA、pbp-1a、pbp-1b基因的相對表達量均顯著下降（P<0.05），而ompA、csuE基因的相對表達量均無顯著變化（P>0.05）。結論：我院MDR-AB菌株的耐藥情況嚴重。sub-MIC頭孢吡肟、環丙沙星、阿米卡星、阿奇霉素對其生物膜的形成具有明顯的抑制作用，其中阿奇霉素的作用最強且呈量效關系。阿奇霉素對MDR-AB菌株生物膜形成的抑制作用可能與其下調bap、filA、pbp-1a、pbp-1b基因的表達有關。

關鍵詞 鮑曼不動桿菌；多重耐藥；生物膜；亞抑菌濃度；抗菌藥物；阿奇霉素；基因表達

中圖分類號 R969.3；R978.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3129-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.23

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of sub-MIC antibiotics on the biofilm formation of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii （MDR-AB）， and to provide reference for the prevention and treatment of related infection. METHODS： Agar plate doubling dilution method was used to detect MIC of clinically isolated A. baumannii （AB） and screen MDR-AB. Microporous method was used to analyze the effects of different doses of sub-MIC antibiotics on the biofilm formation of MDR-AB， which was validated by using AB standard strain （ATCC 17978）. The expression of biofilm-related gene was detected by RT-PCR. RESULTS： The detected MDR-AB was resistant to carbapenems， cephalosporins， quinolones， aminoglycosides， tetracyclines and macrolides （MIC≥16 μg/mL）. It was sensitive to polymyxin B and tegocycline （MIC≤8 μg/mL）. Different doses of sub-MIC cefepime， ciprofloxacin， azithromycin and amikacin could significantly inhibit the biofilm formation of MDR-AB， and azithromycin had the strongest inhibitory effect （the relative biofilm formation values of the corresponding strains was minimal）. Doxycycline could significantly induce the formation of biofilm in most strains， but meropenem， cefoperazone， tigacycline， gentamicin and polymyxin B had no significant effect on the formation of biofilm. Results of validation test showed that compared with untreated control strains， the relative biofilm formation values of standard strains were decreased significantly after treated with 0.25 and 0.125 μg/mL azithromycin and 0.25 μg/mL amikacin （P<0.05）， and inhibitory effect of azithromycin showed a dose-dependent relationship （P<0.05）. Results of gene expression detection showed that compared with untreated control strains， relative expression of bap， filA， pbp-1a and pbp-1b gene were decreased significantly （P<0.05）， while relative expression of ompA and csuE gene had no significant change （P>0.05）. CONCLUSIONS： The drug resistance of MDR-AB strains in our hospital is serious. Sub-MIC cefepime， ciprofloxacin， amikacin and azithromycin shows significant inhibitory effect on biofilm formation， and the inhibitory effect of azithromycin is the strongest， with dose-dependent manner. Azithromycin can inhibit the biofilm formation of MDR-AB which may be associated with the expression down-regulation of bap， filA， pbp-1a and pbp-1b gene.

KEYWORDS Acinetobacter baumannii； Multi-drug resistance； Biofilm； Sub-MIC； Antibiotics； Azithromycin； Gene expression

鮑曼不動桿菌（AB）是導致院內感染的主要病原菌之一，且多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDR-AB，即對3類或3類以上抗菌藥物耐藥的AB）在臨床較為常見，而該類細菌可形成生物膜（Biofilm），最終可造成難以徹底清除的感染[1]。有研究指出，在重癥監護病房（ICU）中雖有高達80%的AB菌株處于抗菌藥物的治療壓力下，但卻無法被迅速清除，這種現象與AB耐藥性強等因素所導致的患者體內抗菌藥物濃度處于低于最低抑菌濃度（MIC）且無法殺滅AB的亞抑菌濃度（sub-MIC）有關[2]。這類sub-MIC抗菌藥物雖無法殺滅病原菌，卻可顯著影響菌株的病原學行為，且其對菌株生物膜形成的影響也可因抗菌藥物種類和菌株的差異而有所不同[3]。因此，探討sub-MIC抗菌藥物對耐藥菌株生物膜形成的影響，并從中篩選具生物膜抑制活性的抗菌藥物對于AB（尤其是MDR-AB）感染的防治具有重要的臨床意義[4]。為此，本研究以陸軍軍醫大學第二附屬醫院（以下簡稱“我院”）臨床分離的MDR-AB為對象，探討sub-MIC抗菌藥物對其生物膜形成的影響，以期為臨床相關感染防治策略的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

THZ-92B型恒溫振蕩培養箱、SPX-150-Z型恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；Power 300型電泳儀、Gel Doc 2000型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；7500型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；Sunrise型酶標儀（奧地利Tecan公司）；MIT-P型多點接種儀（日本Sakuma公司）；MR23i型低溫離心機（法國Jouan公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；BP221S型電子天平（德國Sartorius公司）；DW-86L338型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

美羅培南對照品[批號：130506-201403，純度：供高效液相色譜法（HPLC）含量測定用]、頭孢哌酮對照品（批號：130420-201105，純度：供含量測定用）、頭孢吡肟對照品（批號：130524-201404，純度：供含量測定用）、環丙沙星對照品（批號：130451-201203，純度：供HPLC法含量測定用）、阿米卡星對照品（批號：130335-200204，純度：供含量測定用）、慶大霉素對照品（批號：130326-201015，純度：供抗生素生物效價測定用）、多西環素對照品（批號：130485-201202，純度：供含量/限量測定用）、阿奇霉素對照品（批號：130593-201303，純度：供含量測定用）均由中國食品藥品檢定研究院提供；多黏菌素B對照品（美國Sigma公司，批號：1222536，純度：供含量測定用）；注射用替加環素（意大利 Pfizer Limited，注冊證號：H20130483，批號：AIXD/12，規格：50 mg）；結晶紫溶液（成都科龍化工試劑廠，批號：2013121101）；RPMI 1640培養基、胎牛血清（美國Gibco公司，批號分別為NAB1335、1221119）；LB培養基、MH培養基（北京陸橋技術股份有限公司，批號分別為150813、151012）；血瓊脂平板（重慶龐通醫療器械有限公司，批號：15K2701）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，美國HyClone公司，批號：NAG1423）；DP430-RNAprep Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號：121221]；PrimeScript RT Reagent Kit逆轉錄試劑盒、RR820A-SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒（日本Takara公司，批號分別為AK3301、AK3101）；引物由美國Invitrogen公司設計、合成；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 菌株

AB臨床分離菌株均來自于我院臨床送檢的標本，剔除同一患者同一部位檢出的重復菌株。質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）以及AB標準菌株（ATCC 17978）均由美國模式培養物集存庫提供。上述菌株均常規保存于陸軍軍醫大學第一附屬醫院國家藥物臨床試驗機構。

2 方法

2.1 臨床分離菌株MIC的測定

以大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）為質控菌株，采用瓊脂平板倍比稀釋法測定臨床分離AB菌株的MIC（MIC反映抗菌藥物對受試菌株的抑制活性，其值越大表明藥物對菌株的抑制活性越弱[5]）。取臨床分離的AB菌株適量，用劃線法接種于血瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養過夜。用接種環挑取單個菌落，用生理鹽水稀釋，制得濃度約為1×108 CFU/mL的菌懸液。取“1.2”項下各抗菌藥物適量，用生理鹽水倍比稀釋后，取1 mL分置于各培養皿中，加入MH培養基適量，混勻；用多點接種儀將上述菌懸液接種至含不同質量濃度抗菌藥物的MH培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h后，參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2015年標準[5]讀取結果，并選取其中耐藥種類最多的10株（即MDR-AB，編號分別為WA0719、WB1387、WB1483、WB1486、WB1531、WB1549、WA0611、WB1055、WB1197、WB1032）進行后續試驗。

2.2 sub-MIC抗菌藥物對菌株生物膜形成影響的半定量分析

選取臨床常用的代表性抗菌藥物（如美羅培南、頭孢哌酮、阿奇霉素等）以及既往對AB具有良好抑制作用的其他抗菌藥物（如多黏菌素B、替加環素、多西環素等），在對應MIC的基礎上兼顧臨床實際可及的組織濃度，設置各抗菌藥物的劑量，以未經藥物作用的菌株作為對照，采用微孔法對各菌株生物膜的形成進行半定量分析[5]。取“2.1”項下臨床分離的MDR-AB菌株適量，用劃線法接種于血瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養過夜；用接種環挑取單個菌落至LB培養基中，于37 ℃恒溫振蕩培養箱中振搖（約130 r/min）培養過夜。用接種環挑取單個菌落，用生理鹽水稀釋，制得濃度約為1×107 CFU/mL的菌懸液，以每孔200 μL加至96孔板中，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，吸棄上層培養液，殘渣用PBS清洗2次，吹干并固定后，每孔加入1%結晶紫溶液150 μL，染色3 min，用超純水洗凈，吹干，每孔加入30%冰醋酸溶液溶解染色液，使用酶標儀在590 nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。OD值的高低可間接反映生物膜形成能力的強弱，且當OD590 nm>0.5時，表明該菌株生物膜形成的能力較強[6]。其中，與未經藥物作用的對照菌株比較，OD590 nm值顯著增加（組間比較P<0.05）的為“顯著誘導”，OD590 nm值無顯著差異（組間比較P>0.05）的為“無顯著影響”，OD590 nm值顯著降低（組間比較P<0.05）的為“顯著抑制”。 “相對生物膜形成”指與對照菌株比較，10株MDR-AB菌株OD值變化的平均水平（其值等于給藥菌株的平均OD值與對照菌株的平均OD值的比值）。為確保試驗的可重復性，本研究以AB標準菌株（ATCC 17978）為對象，選取對臨床分離菌株生物膜形成具有明顯抑制作用的抗菌藥物進行驗證，并設置更低的劑量以探討其量效關系。上述試驗重復3次。

2.3 MDR-AB菌株生物膜形成相關調控基因表達的測定

以未經藥物作用的菌株作為對照，采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）測定MDR-AB菌株生物膜形成相關調控基因的表達情況。按照培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒說明書方法提取細菌總RNA，按照逆轉錄和熒光定量試劑盒說明書方法將RNA逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA），隨后使用熒光定量PCR儀進行擴增（引物序列見表1）。PCR反應體系：2×SYBR Green（熒光定量試劑盒內所含試劑）10 ?L，上、下游引物各0.3 ?L，cDNA 2 ?L，ddH2O 7.4 ?L。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；72 ℃再延伸10 min。SYBR Green試劑的激發波長和發射波長分別為497 nm和520 nm。以表達穩定的16SrRNA為內參，通過檢測擴增過程中熒光強度的變化，采用ABI-7500 2.0軟件以2-ΔΔCt分析各基因的表達量，并計算相對表達量（相對表達量=給藥菌株的基因表達量/對照菌株的基因表達量）。上述試驗重復3次。

2.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 臨床分離MDR-AB菌株的MIC值

10株MDR-AB菌株對10種臨床常用抗菌藥物的MIC值見表2。由表2可見，10株菌株對碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類抗菌藥物耐藥，而對多黏菌素B和替加環素較敏感。

3.2 sub-MIC抗菌藥物對臨床分離MDR-AB菌株生物膜形成的影響

10株MDR-AB菌株分別來自于痰液、腦脊液、血液、傷口分泌物和尿液標本，涉及最常被該類菌株感染的人體部位，具有一定的代表性[7]。以不同劑量的sub-MIC抗菌藥物對MDR-AB菌株生物膜的形成進行干預，結果見表3。由表3可見，頭孢吡肟、環丙沙星、阿奇霉素、阿米卡星等4種抗菌藥物對MDR-AB菌株生物膜的形成具有較強的抑制作用，且阿奇霉素的抑制作用相對最強（其相對生物膜形成值最小，2 μg/mL即可顯示出較強的抑制作用）；多西環素對MDR-AB菌株生物膜的形成具有較明顯的誘導作用；而美羅培南、頭孢哌酮、替加環素、慶大霉素、多黏菌素B對其生物膜形成的影響不明顯。

以標準菌株為對象，選取阿奇霉素和阿米卡星進行驗證試驗，結果見表4。由表4可見，與未經藥物作用的對照菌株比較，經0.25、0.125 μg/mL阿奇霉素以及0.25 μg/mL阿米卡星作用后，標準菌株的相對生物膜形成值均顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05），提示其生物膜形成受到明顯抑制。此外，0.25、0.125、0.06 μg/mL阿奇霉素組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05），提示這種體外抑制作用呈明顯的量效關系；而阿米卡星對其生物膜形成的抑制作用則未見類似量效關系（P>0.05）。

在研究過程中筆者還發現，WB1549菌株生物膜形成受到阿奇霉素和阿米卡星的抑制較顯著（相對生物膜形成值均低于0.8），且該菌株來自于呼吸道感染者的痰液標本，而阿奇霉素常用于呼吸道感染的治療，故將其作為后續機制研究的代表菌株。

3.3 sub-MIC阿奇霉素對WB1549菌株生物膜形成相關調控基因表達的影響

以0.25 μg/mL（驗證試驗顯示，該劑量的抑制作用最強）阿奇霉素作用于WB1549菌株后，對其生物膜形成相關調控基因表達的變化情況進行分析，結果見圖1。由圖1可見，6個生物膜形成相關調控基因中有4個基因的表達受到顯著抑制（P<0.05），包括生物膜相關蛋白（BAP）編碼基因bap、Ⅲ型菌毛合成的調控基因filA以及與膜結構相關的青霉素結合蛋白（PBPs）編碼基因pbp-1a、pbp-1b；而外膜蛋白（OMPA）編碼基因ompA和調控菌毛合成的csu家族基因csuE的表達則未見顯著變化（P>0.05）。這提示阿奇霉素影響了MDR-AB菌株生物膜形成的多個調控途徑，包括影響Ⅲ型菌毛的合成、生物膜的完整性以及生物膜蛋白的合成。

4 討論

隨著抗菌藥物的廣泛應用及濫用，MDR-AB菌株的臨床檢出率日益增高[8]。本研究MIC測定結果顯示，我院臨床檢出的MDR-AB菌株對多類常用抗菌藥物耐藥，包括碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類等。這提示當患者受到MDR-AB菌株感染時，臨床可供選擇的抗菌藥物有限；此外這也提示，許多抗菌藥物的常規治療濃度難以達到抑制MDR-AB菌株的MIC而處于sub-MIC。在此背景下，探討sub-MIC抗菌藥物對MDR-AB菌株生物膜形成的影響具有極大的臨床價值。

本研究結果顯示，不同劑量sub-MIC抗菌藥物對MDR-AB菌株生物膜的形成會產生不同影響。其中，有明顯誘導作用的為多西環素，影響不明顯的包括美羅培南、頭孢哌酮、替加環素、慶大霉素、多黏菌素B等，而頭孢吡肟、環丙沙星、阿奇霉素和阿米卡星則表現出了明顯的抑制作用，且阿奇霉素的抑制作用相對最強（2 μg/mL即可顯示出較強的抑制作用），其量效關系在基因背景清楚的AB標準菌株（ATCC 17978）中得到了驗證。已有研究表明，阿奇霉素對銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌的生物膜形成具有抑制作用[9]，但其對MDR-AB菌株生物膜形成的影響尚未見相關報道，故本課題組在上述研究的基礎上，進一步分析了sub-MIC阿奇霉素影響MDR-AB菌株生物膜形成的可能機制。

MDR-AB菌株生物膜形成的調控機制復雜，目前尚未完全闡明。已有研究顯示，其生物膜形成可能與BAP蛋白、OMPA蛋白、膜結構蛋白編碼基因以及細菌運動相關基因的表達有關[10]，因此筆者推測sub-MIC抗菌藥物對MDR-AB菌株生物膜形成的影響亦有可能涉及以上靶點。相關研究證實，BAP蛋白可通過促進菌株的黏附來誘導其生物膜的形成[10]。本研究結果顯示，經sub-MIC阿奇霉素作用后，bap基因的表達受到顯著抑制，但具體機制仍有待進一步研究。OMPA蛋白可誘導菌株黏附或侵襲上皮細胞，促進其生物膜形成，增強其活性[11]，但本研究并未發現阿奇霉素對其編碼基因ompA表達的影響，提示該基因可能并非阿奇霉素的作用靶點。值得注意的是，AB菌株沒有鞭毛，菌毛是其主要的運動器官，且生物膜的形成與之密切相關[12]。盡管csu基因家族（csuA/BABCDE）編碼蛋白可影響細菌菌毛的合成，但本研究并未發現關鍵調控基因csuE表達的顯著改變，提示csu基因家族介導的菌毛合成可能并未參與阿奇霉素的作用過程[12]。Ⅲ型菌毛相關基因filA調控Ⅲ型菌毛的合成[12]。本研究結果顯示，經sub-MIC阿奇霉素作用后，其表達受到了顯著抑制，表明該基因可能是阿奇霉素的作用靶點。PBPs蛋白可與青霉素G共價結合，是一類廣泛存在于細菌表面的膜蛋白。該蛋白參與了細菌細胞壁的合成和糖肽結構的形成，對維持細菌的正常形態具有重要的作用[13]。已有研究表明，大腸埃希菌中PBPs蛋白表達的下調會影響其細胞壁的結構，從而影響鞭毛的活力，導致細菌運動力受損[13]。后續研究顯示，PBP1a、PBP2a、PBPB2等蛋白及其編碼基因的缺失對變形鏈球菌[14]、金黃色葡萄球菌[15]等多種細菌的分裂、生長或生物膜形成均有顯著影響，但尚未見PBPs對MDR-AB菌株生物膜形成影響的相關報道。本研究結果顯示，經sub-MIC阿奇霉素作用后，MDR-AB菌株中PBPs蛋白編碼基因pbp-1a、pbp-1b的表達均顯著下降，提示PBPs蛋白可能參與了該菌株生物膜的形成，而阿奇霉素對其調控的具體機制仍需進一步探討。

綜上所述，我院MDR-AB菌株的耐藥情況嚴重。sub-MIC頭孢吡肟、環丙沙星、阿米卡星、阿奇霉素對其生物膜的形成具有明顯的抑制作用，其中阿奇霉素的作用最強且呈量效關系。阿奇霉素對MDR-AB菌株生物膜形成的抑制作用可能與其下調bap、filA、pbp-1a、pbp-1b基因的表達有關。但目前對該菌的研究多集中在其流行病學特征上，而對其生物膜形成等病原學行為機制的探討甚少，故本研究的結論及其具體機制仍有待后續研究進一步驗證。

參考文獻

[ 1 ] ANTUNES LC，VISCA P，TOWNER KJ. Acinetobacter baumannii：evolution of a global pathogen[J]. Pathog Dis，2014，71（3）：292-301.

[ 2 ] DAI XT，SUN FJ，CHEN ZH，et al. The epidemiology and resistance mechanisms of Acinetobacter baumannii isolates from the respiratory department ICU of a hospital in China[J]. Microb Drug Resist，2014，20（6）：618-622.

[ 3 ] 枉前，孫鳳軍，夏培元. 亞抑菌濃度抗生素對細菌生物膜形成的影響[J]. 中國抗生素雜志，2009，34（4）：200-204.

[ 4 ] HOWARD A，ODONOGHUE M，FEENEY A，et al. Acinetobacter baumannii：an emerging opportunistic pathogen[J]. Virulence，2012，3（3）：243-250.

[ 5 ] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：25th informational supplement[S]. 2015-01.

[ 6 ] CRAMTON SE，GERKE C，G?TZ F. In vitro methods to study staphylococcal biofilm formation[J]. Methods Enzymol，2001，336：239-255.

[ 7 ] SHIN B，PARK W. Antibiotic resistance of pathogenic Acinetobacter species and emerging combination therapy[J]. J Microbiol，2017，55（11）：837-849.

[ 8 ] EVANS BA，HAMOUDA A，AMYES SG. The rise of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii[J]. Curr Pharm Des，2013，19（2）：223-238.

[ 9 ] DAS MC，SANDHU P，GUPTA P，et al. Attenuation of Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by vitexin：a combinatorial study with azithromycin and gentamicin[J]. Sci Rep，2016. DOI：10.1038/srep23347.

[10] LONGO F，VUOTTO C，DONELLI G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii[J]. New Microbiol，2014，37（2）：119-127.

[11] GADDY JA，TOMARAS AP，ACTIS LA. The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA protein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and in the interaction of this pathogen with eukaryotic cells[J]. Infect Immun，2009，77（8）：3150-3160.

[12] MCQUEARY CN，ACTIS LA. Acinetobacter baumannii biofilms：variations among strains and correlations with other cell properties[J]. J Microbiol，2011，49（2）：243-250.

[13] EVANS KL，KANNAN S，LI G，et al. Eliminating a set of four penicillin binding proteins triggers the Rcs phosphorelay and Cpx stress responses in Escherichia coli[J]. J Bacteriol，2013，195（19）：4415-4424.

[14] WEN ZT，BITOUN JP，LIAO S. PBP1a-deficiency causes major defects in cell division，growth and biofilm formation by Streptococcus mutans[J]. PLoS One，2015，10（4）：e0124319.

[15] SANTIAGO C，LIM KH，LOH HS，et al. Prevention of cell-surface attachment and reduction of penicillin-binding protein 2a （PBP2a） level in methicillin-resistant Staphylococcus aureus biofilms by Acalypha wilkesiana[J]. BMC Complement Altern Med，2015. DOI：10.1186/s12906-015-0615-6.

（收稿日期：2018-08-24 修回日期：2018-09-25）

（編輯：張元媛）