PD—L1和P63在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義

張長忠 馮瑤 鄭繪霞

【摘要】 目的：探討PD-L1和P63在彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中的表達及臨床意義。方法：選取2013年1月-2017年10月山西醫科大學第一醫院收治的DLBCL患者65例為研究組，另外選取同期反應性增生淋巴結組織患者20例為對照組。采用免疫組化Envsion法檢測兩組PD-L1和P63的表達情況，分析PD-L1、P63的表達與DLBCL臨床病理特征之間的關系，并分析DLBCL組織中PD-L1與P63表達的相關性。結果：研究組中PD-L1、P63的陽性表達率均高于對照組（P<0.05），且P63在反應性增生淋巴結組織中均呈陰性；PD-L1、P63的表達均與DLBCL患者年齡、性別、分期、發生部位及LDH水平無相關性（P>0.05）；但PD-L1表達與DLBCL患者IPI評分相關（P<0.05），P63表達與DLBCL患者IPI評分無相關性（P>0.05）；在DLBCL組織中，PD-L1與P63的表達呈正相關（r=0.252，P=0.043）。結論：PD-L1、P63在DLBCL中均有表達，有助于診斷和預后評估。

【關鍵詞】 彌漫大B細胞淋巴瘤； PD-L1； P63； 表達； 臨床意義

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 and P63 in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）.Method：A total of 65 DLBCL patients in the First Hospital of Shanxi Medical University from January 2013 to October 2017 were selected as study group，and 20 patients with reactive lymph node hyperplasia were selected as control group.Immunohistochemical Envsion method was used to detect the expression of PD-L1 and P63 in two groups.The relationship between the expression of PD-L1 and P63 and the clinicopathological features of DLBCL was analyzed，and the correlation between the expression of PD-L1 and P63 in the DLBCL tissues was analyzed.Result：The positive rates of PD-L1 and P63 in study group were higher than those of control group（P<0.05），and P63 was negative in reactive hyperplastic lymph nodes.There was no correlation between the expression of PD-L1 and P63 with age，sex，staging，location and LDH level of DLBCL patients（P>0.05），but the expression of PD-L1 was associated with IPI score in DLBCL patients（P<0.05），and there was no correlation between P63 expression and IPI score in DLBCL patients（P>0.05）.In DLBCL tissues，PD-L1 was positively correlated with P63 expression（r=0.252，P=0.043）.Conclusion：Both PD-L1 and P63 are expressed in DLBCL，which is helpful for diagnosis and prognosis evaluation.

【Key words】 Diffuse large B cell lymphoma； PD-L1； P63； Expression； Clinical significance

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.002

彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見的一類非霍奇金淋巴瘤（NHL），占NHL的30%～40%。DLBCL的臨床表現、組織形態學、免疫表型、分子遺傳學特征極具異質性[1]。目前，聯合化療可以使大約45%的患者達到持續緩解，但仍有大部分DLBCL患者不能達到緩解，或出現緩解后復發。因此通過多種檢查手段早期識別DLBCL預后較差的亞群，對于預后判斷和治療選擇具有重要作用。目前臨床上有效預測療效或復發的指標是國際預后指數（international prognostic index，IPI），IPI主要是一些臨床指標的結合，不包括腫瘤細胞的分子指標[2]。近年來，隨著對DLBCL發病機制的深入研究，有研究認為腫瘤分子指標可能對DLBCL的診斷、治療及預后有很高價值。程序性細胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）又名B7-H1，是B7家族的新成員，是近年來發現的與腫瘤免疫逃逸有關的重要分子之一[3]。PD-L1可以與程序性細胞死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）特異性結合，從而控制免疫反應的強度，產生抑制性反應，T細胞的活化、增殖被抑制，導致T細胞凋亡，不能很好地發揮T細胞的抗腫瘤效應。國外一些研究發現，在胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、腎細胞癌、膠質瘤和尿路上皮癌等組織中可以檢測到PD-L1蛋白的異常表達，且PD-L1的表達與預后呈負相關[4]。P63屬于P53基因家族，眾所周知P53是一種腫瘤抑制基因，其基因的失活對腫瘤形成起重要作用。P63在腫瘤發生機制中所起的作用目前還不清楚。目前研究證實P63與組織發育密切相關，并可促進腫瘤的生長[5]。PD-L1、P63在DLBCL中的表達以及表達的相關性國內外研究比較少見。因此本文通過免疫組化法觀察DLBCL組織中PD-L1和P63的表達，分析PD-L1、P63表達與DLBCL患者臨床病理特征之間的關系，并分析DLBCL中PD-L1與P63表達的相關性?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2017年10月山西醫科大學第一醫院收治的DLBCL患者65例為研究組。納入標準：DLBCL患者術前均未經任何形式的放化療及靶向治療；DLBCL患者均獲取足夠組織，均常規固定、脫水、包埋、切片、HE染色，并進行免疫組化檢查，切片由兩名主任醫師確診為DLBCL，符合DLBCL的WHO診斷標準[6]。排除標準：沒有常規病理確診的患者（常規病理不符合DLBCL的診斷標準）；臨床病理資料不完整的患者；合并其他組織部位的惡性腫瘤或轉移性腫瘤的患者。另外選取同期反應性增生淋巴結組織患者20例為對照組。患者均對本研究知情，且本研究已經院倫理委員會審核批準。

1.2 免疫組化 采用免疫組化Envsion法進行免疫組化染色，P63、PD-L1抗體購自福州邁新公司和Dako公司。染色步驟：取選好的組織蠟塊置于切片機，一般4 μm厚；將石蠟切片置于烤片機烘烤2～3 h；常規脫蠟；使用檸檬酸鹽在高壓鍋進行抗原修復；用磷酸鹽緩沖液沖洗后加一抗，放入37 ℃孵箱2 h；再次磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加二抗，蓋過組織，放入37 ℃孵箱25 min；再次磷酸鹽緩沖液沖洗，用移液管滴加DAB顯色劑；放入蘇木精罐復染約5 min；涼水沖洗-1%鹽酸酒精-涼水沖洗-氨水-涼水沖洗；乙醇脫水，二甲苯透明；滴加樹脂封片。免疫組化已設置陽性、陰性對照。免疫組化結果判定：PD-L1陽性部位為腫瘤細胞的細胞膜和/或細胞質，陽性閾值為10%[7]；P63陽性部位為細胞核，陽性閾值為30%[8]。

1.3 觀察指標 觀察兩組PD-L1與P63表達情況；分析PD-L1、P63的表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系；分析PD-L1與P63在DLBCL中表達的相關性。

1.4 統計學處理 使用SPSS 21.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗；采用Pearson相關性分析PD-L1和P63在DLBCL組織中表達的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 研究組男34例，女

31例；發病年齡40～85歲，平均（63.00±11.32）歲；AnnArbor分期：Ⅰ期、Ⅱ期32例，Ⅲ期、Ⅳ期33例；淋巴結內病灶32例，結外病灶33例；乳酸脫氫酶（LDH）正常者32例，升高者33例；淋巴瘤國際預后（IPI）評分：0～2分者32例，IPI評分>2分者33例；生發中心型25例，非生發中心型40例。對照組男11例，女9例；年齡35～70歲，平均年齡（55.00±9.50）歲。兩組性別、年齡比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組中PD-L1與P63表達情況比較 研究組中PD-L1、P63的陽性表達率均高于對照組（字2=3.856、8.047，P<0.05），且P63在反應性增生淋巴結組織中均呈陰性。見表1和圖1～4。

2.3 PD-L1、P63的表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系 PD-L1、P63的表達均與DLBCL患者年齡、性別、分期、發生部位及LDH水平無相關性（P>0.05）；但PD-L1表達與DLBCL患者IPI評分相關（P<0.05）；P63表達與DLBCL患者IPI評分無相關性（P>0.05）。見表2。

2.4 PD-L1與P63在DLBCL中表達的相關性分析 在DLBCL組織中，PD-L1與P63的表達呈正相關（r=0.252，P=0.043）。見表3。

3 討論

有研究證實心肌、骨骼肌、胎盤、肺等組織中可以檢測到PD-L1 mRNA，而正常組織中卻很少能檢測到PD-L1蛋白的表達，可以發現PD-L1蛋白表達受轉錄后調控。在人體巨噬細胞系如扁桃體副皮質區的組織細胞、肝臟巨噬細胞、肺泡巨噬細胞等可檢測到PD-L1蛋白的表達[3]。除了在免疫部位表達，PD-L1也表達于各種非造血細胞如上皮細胞、肌細胞、肝細胞、胰島細胞、星形膠質細胞、血管內皮細胞等[4]。PD-L1在淋巴組織和非淋巴組織上的表達，說明PD-L1可以調節這些組織的炎癥反應以及自身反應性T細胞或B細胞。近年來，隨著PD-1/PD-L1通路抗體以及cART細胞免疫療法的陸續上市，腫瘤免疫療法成為一個炙手可熱的研發領域。免疫治療給非小細胞肺癌、黑色素瘤、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤、白血病等疾病來了新的治療希望。PD-L1參與腫瘤免疫逃逸并且利用PD-L1進行腫瘤免疫治療的相關研究，已經成為國內外學者廣泛研究和關注的熱點。

T細胞是機體抗腫瘤細胞的重要細胞。激活T細胞需要兩個信號分別是抗原肽-MHC分子復合物與T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）相互作用的抗原特異性信號，以及共刺激分子所表達的共刺激信號[9]。兩個信號同時作用時，才能激活T細胞，并維持T細胞的正常功能。PD-L1與PD-1的特異性結合可以抑制T細胞功能，機體免疫受到抑制，最終抑制了T細胞的抗腫瘤效應[3]。研究表明PD-L1在多種腫瘤組織中高表達，如胃癌、肺癌、肝癌、宮頸癌、淋巴瘤、胰腺癌、膠質瘤、尿路上皮癌等。由于PD-L1的高表達抑制了T細胞的功能，PD-L1的表達與腫瘤患者的預后呈負相關[10]。Konishi等[11]發現在非小細胞肺癌手術切除標本中PD-L1表達陽性，并且發現PD-L1陽性區腫瘤浸潤性淋巴細胞比PD-L1陰性區顯著減少，提示PD-L1在抗腫瘤免疫中的負性調控作用。Andorsky等[4]研究認為，間變性大細胞淋巴瘤（ALCL）和一些DLBCL組織中表達PD-L1，且局限于非生發中心起源的DLBCL中，腫瘤細胞上PD-L1的表達抑制了殺傷性T細胞的活性。在DLBCL中，可能通過PD-LI的過表達來進行免疫逃避，從而促進淋巴瘤細胞的生長。本研究結果顯示，PD-L1在DLBCL組織和反應性增生淋巴組織中均有表達，且研究組中PD-L1陽性表達率高于對照組（P<0.05），與文獻[12]報道相符。PD-L1在多種腫瘤中都有過高表達的現象，且與患者的預后呈負相關，PD-L1表達越高，預后越差[13]。本研究結果顯示，IPI>2分的DLBCL中PD-L1的表達明顯高于IPI≤2分的DLBCL（P<0.05）。眾所周知，IPI評分高，提示DLBCL預后差，本研究中PD-L1在IPI積分高的患者表達也高，提示預后也差。

P63基因是腫瘤抑制因子P53基因家族中的一員，結構與P53類似，位于染色體3q27-3q29。P63包含兩種亞型：TAp63和△Np63。兩者功能有明顯的差異：TAp63表達升高會促進細胞的凋亡；△Np63表達升高會抑制細胞的凋亡，具有癌基因功能[14]。P63對細胞穩態和胚胎、表皮發育至關重要。目前有研究發現，P63在淋巴瘤中異常表達，與淋巴瘤的增殖和凋亡有相關性，認為P63在淋巴瘤中可能起癌基因作用[15-21]。P63異常表達和結構異?？梢栽诙喾N類型的淋巴瘤中發現[20-21]。還有研究發現，P63的表達與惡性淋巴瘤細胞的分化階段有相關性，P63高表達于特殊類型如T淋巴母細胞淋巴瘤[16]。檢測P63對淋巴瘤的診斷、惡性程度的判斷、臨床療效及預后的判斷起重要作用。此外，Fukushima等[5]發現，P63在34%的DLBCL腫瘤細胞中核表達，并且P63陽性的非生發中心DLBCL預后差。本研究結果顯示，P63在DLBCL中陽性率為30.8%，而在反應性增生淋巴結呈陰性表達，比較差異有統計學意義（P<0.05），進一步提示P63在DLBCL中起癌基因作用。

近年來，一些研究表明PD-L1的高表達可能是由許多癌基因或者遺傳變異引起的。據報道PTEN的功能喪失可能會上調腫瘤細胞中PD-L1的表達，導致PD-L1的過表達[18]。有趣的是，Georgiou等[19]發現DLBCL中存在PD-L1和P63之間的易位，并且RNA測序數據也表明，PD-L1的高表達是伴隨著P63的表達。PI3K/AKT/mTOR信號通路在多種腫瘤細胞中異常激活，與癌癥的發生發展密切相關。研究表明，在DLBCL惡性進展過程中，PI3K/Akt信號轉導通路可被PD-1/PD-L1直接激活[21]。同樣的，P63可以調節mTOR信號，這在DNA損傷的進展中起關鍵作用[22]。因此，本研究推測PD-L1/P63的表達可能激活一些重要的細胞內信號，導致腫瘤的發生發展。本研究結果顯示，在DLBCL組織中，PD-L1與P63的表達呈正相關（P<0.05），相關性不是特別明顯，可能與樣本量小有關。

綜上所述，本研究表明PD-L1和P63在一些DLBCL中高表達；PD-L1和P63與患者預后不良相關，為預后不良的指標；PD-L1與P63在DLBCL組織中顯示微弱的相關性，還需要更大的樣本量和進一步的研究來研究PD-L1和P63的表達是否有協同作用，以及是否PD-L1和P63的轉錄融合在DLBCL的進展過程中起著關鍵的作用。

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