固相萃取-高效液相色譜法測定養(yǎng)殖污水中強力霉素殘留

張圣新 朱磊 鮑恩東 王冉 魏瑞成

評估實驗室（南京）/江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇南京 210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095] 摘要：為了監(jiān)測養(yǎng)殖場排污水中獸藥抗生素污染狀況，擬建立1種固相萃取-高效液相色譜方法測定養(yǎng)殖場污水中強力霉素殘留。養(yǎng)殖場排污水離心后取上清液過濾膜并調(diào)整溶液pH值，分別采用固相萃取柱進(jìn)行富集和洗脫，氮吹濃縮處理，C18色譜柱分離，0.01 mol/L乙二酸溶液+甲醇-乙腈溶液洗脫。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8;在10～50 μg/L添加濃度范圍內(nèi)，強力霉素平均回收率為91.55%～9514%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.66%～6.45%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.75%，該方法的檢測限為 0.1 μg/mL。該方法操作簡便、高效，適用于養(yǎng)殖場排污水中強力霉素殘留的快速測定。

關(guān)鍵詞：強力霉素;固相萃取;高效液相色譜;抗生素殘留;檢測方法

中圖分類號：X839.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0249-03

獸藥抗生素在現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展和動物性產(chǎn)品的豐富供給方面發(fā)揮了重要作用。據(jù)報道，2013年我國用在養(yǎng)殖業(yè)中的抗生素量約為8.4萬t，約占其生產(chǎn)總量的52%，相當(dāng)于美國養(yǎng)殖業(yè)使用量的6倍[1]。然而藥物在動物體內(nèi)的利用效率不高，高達(dá)90%的飼用抗生素將以母體或代謝產(chǎn)物的形式隨畜禽糞尿排出體外，對環(huán)境產(chǎn)生污染[2-3]。目前，在動物糞便、土壤、水體等樣品中檢出多種抗生素殘留[2，4-6]，其中四環(huán)素類藥物作為養(yǎng)殖場常用獸藥，在環(huán)境中的檢出率相對較高[7-8]。強力霉素（doxycycline，簡稱DOX）為四環(huán)素類抗生素的一種，于1967年獲得食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，簡稱FDA）批準(zhǔn)，因其具有良好的組織穿透性、分布廣和抑菌作用強等特點而被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[9]，是目前養(yǎng)殖業(yè)使用的主要四環(huán)素類藥物之一。飼喂動物后，約有85%的強力霉素以原形或代謝物形式隨糞尿排出[10]。養(yǎng)殖場水沖糞、水泡糞清糞工藝產(chǎn)生的污水較多，殘留的抗生素隨同污水排放進(jìn)入環(huán)境，使得環(huán)境中微生物處于長期選擇壓下，將誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗性[11]，破壞環(huán)境生態(tài)平衡，并發(fā)生縱向傳遞和橫向傳播，對生態(tài)環(huán)境和食品安全造成威脅[12-13]。

目前，已報道的強力霉素檢測方法主要用于動物產(chǎn)品和飼料等養(yǎng)殖投入品[14-15]，養(yǎng)殖污水等環(huán)境基質(zhì)中強力霉素殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)缺失，色譜檢測方法也鮮有報道。因此，建立方法簡便、快速、高效和靈敏的養(yǎng)殖糞污水中強力霉素殘留的測定方法，可為研究強力霉素在環(huán)境中的行為、評估其對水生生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)風(fēng)險以及環(huán)境風(fēng)險提供技術(shù)支撐，也為糞污中其他類抗生素測定方法的建立提供參考和借鑒，對抗生素的科學(xué)監(jiān)管、合理使用以及制定養(yǎng)殖場抗生素排放標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。強力霉素的結(jié)構(gòu)見圖1。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

強力霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97.0%），購自Dr. Ehrenstorfer公司;甲醇和乙腈（色譜純），購自美國天地（TEDIA）公司;鹽酸和氫氧化鈉（分析純），購自南京化學(xué)試劑一廠;乙二胺四乙酸二鈉和乙二酸（分析純），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸和磷酸氫二鈉（分析純），購自西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent 1100S，配二極管陣列檢測器DAD），購自Agilent公司;分析天平（AL204）、pH計（320），購自梅特勒-托利多儀器有限公司;漩渦混合器（XW-80A），購自上海琪特分析儀器有限公司;調(diào)速多用振蕩器（HY-4），購自常州國華電器有限公司;高速離心機（Eppendorf），購自德國Eppendorf公司;超純水儀（Milli-Q），購自美國Millipore公司;氮吹儀（N-EVAPTM112），購自美國Organomation公司;固相萃取裝置，購自美國Supelco公司;HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL），購自美國Waters公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取強力霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，吸取一定量的儲備液，用甲醇配成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃避光存放。用流動相稀釋中間液配制濃度為1、5、7、10、20 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光存放，1周更換。

1.4 提取和凈化方法

污水取自養(yǎng)殖場凈化池后流出液，將采集的樣品低溫運送回試驗室，4 ℃、8 000 r/min離心后取上清液過0.8 μm濾膜，加入20 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-檸檬酸緩沖溶液到1 L過濾樣液中，調(diào)節(jié)pH值至6后過HLB（親脂-親水平衡）柱凈化。固相萃取HLB柱依次用甲醇和0.1 mol/L Na2EDTA-檸檬酸緩沖溶液（pH值為4）各6 mL進(jìn)行活化，然后取 100 mL 調(diào)節(jié)pH值后的樣液過柱凈化，樣液裝載流速為 3 mL/min，用10 mL水淋洗并真空抽干，然后用8 mL甲醇洗脫，洗脫速度為1 mL/min，在10 mL離心管中收集洗脫液，在40 ℃水浴中用氮氣濃縮至近干，加入1 mL流動相溶解殘余物，過0.22 μm孔徑有機濾膜后用于高效液相色譜儀測定。

1.5 高效液相色譜（HPLC）測定

色譜柱為Agilent C18 250 mm×4.6 mm，5 μm;流動相001 mol/L乙二酸溶液 ∶ 甲醇-乙腈溶液（甲醇和乙腈體積比為1 ∶ 1）比例為65 ∶ 35;柱溫為30 ℃;流速設(shè)定為1.0 mL/min;檢測器波長為350 nm;進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相條件的優(yōu)化

為了減少樣品中雜質(zhì)峰的干擾，試驗對流動相的配比進(jìn)行了優(yōu)化，選擇0.01 mol/L乙二酸溶液+甲醇-乙腈為流動相，比較流動相組成比例分別為60 ∶ 40、65 ∶ 35和70 ∶ 30時對色譜峰的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相中的甲醇-乙腈增加時，即有機相的比例增加時，強力霉素出峰時間前移，目標(biāo)物的色譜峰與樣品中的雜質(zhì)峰分離度降低;當(dāng)有機相組成減少時，強力霉素出峰時間延后，將增加樣品分析的時間與試驗成本，尤其是在對批量樣品分析的情況下。綜合上述試驗結(jié)果，流動相配比為65 ∶ 35時可以較好地滿足分析需要。

2.2 前處理條件優(yōu)化

養(yǎng)殖場凈化池為糞水混合物，在好氧與厭氧發(fā)酵等條件下，依靠物理化學(xué)和微生物的作用促進(jìn)殘留抗生素的降解。由于產(chǎn)生的污水多為懸濁液，易堵塞固相萃取柱，影響過柱效率及降低吸收富集的效果。試驗中通過高速離心去除大顆粒懸浮物的干擾，然后利用0.8 μm水相濾膜過濾掉溶液中的小粒徑顆粒，強力霉素屬于小分子化合物，試驗發(fā)現(xiàn)離心和過濾基本不影響其在污水中的殘留。

2.3 固相萃取-高效液相色譜法的建立

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 對1～20 μg/mL強力霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，每個濃度重復(fù)測定4次取平均值，根據(jù)色譜峰面積（y）與強力霉素濃度（x）作線性回歸分析，強力霉素在濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=10.456 0x-2.277 8，相關(guān)系數(shù)大于0.99。強力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和添加樣品在試驗優(yōu)化的色譜條件下的譜圖見圖2，目標(biāo)藥物色譜保留時間為 9.706 min，由于室溫的影響，色譜保留時間在很小范圍內(nèi)波動，控制柱溫可以消除影響，在分析過程中目標(biāo)物色譜峰與雜質(zhì)峰具有很好的分離度，保證了目標(biāo)化合物分析的準(zhǔn)確性。

2.3.2 回收率、精密度與檢出限 用空白污水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液到空白污水中，配成強力霉素濃度分別為10、20、50 μg/L的待測樣品，每個濃度設(shè)3個平行。分別取100 mL待測樣液按照上述處理方法對待測樣品進(jìn)行制備處理，進(jìn)行HPLC測定，計算強力霉素在養(yǎng)殖污水中批內(nèi)和批間的回收率和精密度，結(jié)果見表1。強力霉素平均回收率為91.55%～95.14%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.66%～6.45%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.75%，說明該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。以能夠產(chǎn)生3倍信噪比（S/N=3）所對應(yīng)的藥物濃度計算方法檢測限（MDL），目標(biāo)藥物的MDL為0.1 μg/mL[16]。

2.4 方法應(yīng)用

利用建立的分析方法測定了6個豬場凈化池流出的污水樣品，分析結(jié)果顯示，豬場污水樣品中強力霉素濃度為0～1508 μg/L。對陽性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收，評價本方法分析實際樣品的能力，結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為88.5%～90.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%，評價結(jié)果滿足方法準(zhǔn)確度和精密度的要求。

3 討論

在方法開發(fā)過程中，由于色譜柱C18反向鍵合相表面分布有硅醇基，四環(huán)素類藥物分子基團與其發(fā)生締合，將造成強力霉素色譜峰在分析柱上的拖尾，影響色譜峰寬及目標(biāo)化合物定量分析的準(zhǔn)確性。因此，為了減少強力霉素色譜峰拖尾情況的發(fā)生，本研究通過優(yōu)化流動相的組成，在流動相中加入一定濃度的乙二酸溶液，以減少目標(biāo)分析物與分析柱之間的鍵合作用力，從而有效減少色譜峰拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生[17]。此外，在試驗過程中，筆者發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場污水的pH值會對目標(biāo)物的回收率產(chǎn)生一定影響。所以本研究通過添加回收試驗，比較了將基質(zhì)pH值分別調(diào)整為3和6時對目標(biāo)物回收率的影響，獲得最適樣品酸堿度。當(dāng)pH值為3時，強力霉素回收率偏低，研究發(fā)現(xiàn)在加樣后的固相萃取柱流出液、淋洗液及隨后的洗脫液中，檢出了強力霉素特征峰，提取液的強酸性改變了固相萃取柱的吸附作用，導(dǎo)致目標(biāo)藥物在柱上保留不充分;將提取液pH值調(diào)整為6時，回收效果滿足試驗要求，表明弱酸性溶劑有利于四環(huán)素類藥物在固相萃取柱中富集。同時在樣品處理過程和固相萃取柱的預(yù)處理液中加入一定濃度的Na2EDTA溶液，可以有效降低樣品中強力霉素與二價離子螯合程度[18]，提高目標(biāo)物的回收率。

4 結(jié)論

通過高速離心去除糞污中懸浮固體物質(zhì)、固相萃取柱去除雜質(zhì)和富集凈化、優(yōu)化溶液pH值及流動相的組成和配比，使得強力霉素的色譜峰與干擾峰分離效果良好。與現(xiàn)有方法比較，高效液相色譜法具有樣品處理過程簡便、試劑消耗低的優(yōu)點，本方法處理簡便、快速，檢測靈敏，適用于養(yǎng)殖場污水中強力霉素殘留的快速測定，為監(jiān)測養(yǎng)殖業(yè)抗生素污染和制訂養(yǎng)殖場抗生素排放標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支撐，也為建立糞污中其他類抗生素測定方法提供了參考和借鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang Q Q，Ying G G，Pan C G，et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China：source analysis，multimedia modeling，and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology，2015，49（11）：6772-6782.

[2]Sarmah A K，Meyer M T，Boxall A B A. A global perspective on the use，sales，exposure pathways，occurrence，fate and effects of veterinary antibiotics （VAs） in the environment[J]. Chemosphere，2006，65（5）：725-759.

[3]Daghrir R，Drogui P. Tetracycline antibiotics in the environment：a review[J]. Environmental Chemistry Letters，2013，11（3）：209-227.

[4]劉新程，董元華，王 輝. 江蘇省集約化養(yǎng)殖畜禽排泄物中四環(huán)素類抗生素殘留調(diào)查[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2008，27（3）：1177-1182.

[5]Batt A L，Bruce I B，Aga D S. Evaluating the vulnerability of surface waters to antibiotic contamination from varying wastewater treatment plant discharges[J]. Environmental Pollution，2006，142（2）：295-302.

[6]Hanna N，Sun P，Sun Q，et al. Presence of antibiotic residues in various environmental compartments of Shandong province in eastern China：its potential for resistance development and ecological and human risk[J]. Environment International，2018，114：131-142.

[7]Xu J，Xu Y，Wang H M，et al. Occurrence of antibiotics and antibiotic resistance genes in a sewage treatment plant and its effluent-receiving river[J]. Chemosphere，2015，119：1379-1385.

[8]Zhao L，Dong Y H，Wang H. Residues of veterinary antibiotics in manures from feedlot livestock in eight provinces of China[J]. Science of the Total Environment，2010，408（5）：1069-1075.

[9]廖治鋒，段新華. 獸用多西環(huán)素的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（5）：76-78.

[10]Peng P C，Wang Y，Liu L Y，et al. The excretion and environmental effects of amoxicillin，ciprofloxacin，and doxycycline residues in layer chicken manure[J]. Poultry Science，2016，95（5）：1033-1041.

[11]Heuer H，Schmitt H，Smalla K. Antibiotic resistance gene spread due to manure application on agricultural fields[J]. Current Opinion in Microbiology，2011，14（3）：236-243.

[12]王 瑞，魏源送. 畜禽糞便中殘留四環(huán)素類抗生素和重金屬的污染特征及其控制[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2013，32（9）：1705-1719.

[13]He L Y，Ying G G，Liu Y S，et al. Discharge of swine wastes risks water quality and food safety：antibiotics and antibiotic resistance genes from swine sources to the receiving environments[J]. Environment International，2016，92/93：210-219.

[14]王旭丹，劉 靜，王庚南，等. 高效液相色譜法檢測雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留方法研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（6）：1579-1584.

[15]賈 濤. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中的四環(huán)素類藥物[J]. 中國乳業(yè)，2015（4）：54-58.

[16]王娜妮，壽 旦，王緒平，等. 移液槍頭式固相微萃取-高效液相色譜法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中的4種生物堿[J]. 色譜，2017，35（1）：14-19.

[17]魏瑞成，王 冉，李 維，等. 豬糞中金霉素殘留的測定方法[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，20（4）：291-295.

[18]Wei R C，Ge F，Huang S Y，et al. Occurrence of veterinary antibiotics in animal wastewater and surface water around farms in Jiangsu Province，China[J]. Chemosphere，2011，82（10）：1408-1414.

收稿日期：2019-01-24

基金項目：國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目（編號：GJFP2018012、GJFP2019012）。

作者簡介：張圣新（1992—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士，研究實習(xí)員，主要從事抗生素安全評價研究。E-mail：17351781405@163.com。

通信作者：魏瑞成，博士，副研究員，主要從事抗生素安全評價研究。E-mail：rcwei79@jaas.ac.cn。