微流控環介導等溫擴增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中的應用價值

蘇華 陳琛 蔣麗娜

[摘要] 目的 探討微流控環介導等溫擴增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中的應用價值。 方法 收集2015年7月～2018年5月河北北方學院附屬第一醫院重癥醫學科膿毒癥患者152例作為研究對象，自然咳痰采集法收集痰液標本99例，經支氣管鏡抽吸法收集標本53例，分別進行細菌培養及微流控環介導等溫核酸檢測，根據細菌培養是否分離到肺炎克雷伯菌分為肺炎克雷伯菌組42例和非肺炎克雷伯菌組110例。 結果 細菌培養檢出肺炎克雷伯菌陽性率為27.6%（42/152），微流控環介導等溫核酸檢測法陽性率為38.8%（59/152），后者陽性率高于前者，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。肺炎克雷伯菌組經微流控環介導等溫核酸擴增法檢出陽性菌37例，其中自然咳痰采集法檢出21例，支氣管鏡抽吸法檢出16例，非肺炎克雷伯菌組檢出陽性菌22例，其中自然咳痰法檢出15例，支氣管鏡抽吸法檢出7例，經支氣管鏡抽吸法和自然咳痰采集法檢測的ROC曲線下面積為0.847和0.836，約登指數前者（0.694）高于后者（0.672）。與細菌培養法的一致性評價（Kappa值為0.604 > 0.600，P < 0.05）比較，兩種檢測方法有較高的一致性。 結論 微流控環介導等溫擴增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中具有快速、靈敏的優勢，與傳統的細菌培養法有較高的一致性，為臨床提供更好的的診療依據。

[關鍵詞] 微流控;環介導等溫擴增;膿毒癥;肺炎克雷伯菌

[中圖分類號] R563.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0144-05

[Abstract] Objective To explore the clinical value of microfluidic loop-mediated isothermal amplification detection in the diagnosis of Klebsiella pneumoniae infection in sepsis patients. Methods From June 2015 to May 2018， 152 sepsis patients who were from the department of ICU of the First Affiliated Hospital of Hebei North University were collected， 99 cases of sputum specimens samples were collected by natural cough method， 53 cases were collected by bronchoscopy. All these samples were simultaneously detected by traditional pathogen culture method and microfluidic loop-mediated isothermal amplification method. According to the traditional bacterial culture result， all cases were divided into two group， 42 cases were Klebsiella pneumoniae infection group and 110 cases were non Klebsiella pneumoniae infection group. Results The positive rate of Klebsiella pneumoniae detected by bacterial culture was 27.6%（42/152）， and by microfluidic loop-mediated isothermal amplification detection was 38.8%（59/152）， which was higher than the former， the difference was statistically significant（P < 0.01）. The method of microfluidics loop-mediated isothermal amplification detected 37 positive cases from Klebsiella pneumoniae infection group， including 21 cases natural cough sample and 16 cases bronchoscopy sample， Non Klebsiella pneumoniae infection group was detected by the method of microfluidics loop-mediated isothermal amplification had 22 cases positive samples，including 15 cases natural cough samples and 7 cases bronchoscopy samples. The area under the ROC curve of the bronchoscopy suction method and natural cough collection method was 0.836 and 0.847. The Jordan index of former （0.694） was higher than the latter （0.672）. The Kappa value was 0.604 > 0.600， P < 0.05， indicating a high consistency between the two methods. Conclusion Microfluidic loop-mediated isothermal amplification has the advantages of rapid and sensitive detection of Klebsiella pneumoniae in sepsis patients， which is highly consistent with the traditional bacterial culture method and can provide better clinical diagnosis and treatment basis.

[Key words] Microfluidics; Loop-mediated isothermal amplification; Sepsis; Klebsiella pneumoniae

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一種常見的革蘭陰性機會致病菌，是引起醫院感染的常見致病菌之一，由于其耐藥性呈逐年升高趨勢，成為導致患者死亡的重要原因，尤其是重癥醫學科的膿毒癥患者，微流控（microfluidics）環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）集成診斷技術是一種新興的分子診斷技術[1]，目前主要用于病原微生物的快速核酸檢測[2-3]，它將微流控的微型化、多通道、易檢測、造價低廉等優點與LAMP技術的高靈敏度、簡便、耗時短等優點[4]相結合，集成了一個新型的診斷技術。本研究探討了微流控環介導等溫擴增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中的應用價值，旨在為臨床醫生提供更好的診療依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇河北北方學院附屬第一醫院（以下簡稱“我院”）2015年7月～2018年5月重癥醫學科膿毒癥患者作為研究對象，收集患者基本臨床資料：年齡、性別、住院天數，膿毒癥的診斷標準參照1991年美國胸科醫師學會和危重病醫學會（ACCP/SCCM）制訂的標準。采集患者的痰液標本152例，其中男87例，女65例，平均年齡（68.2±15.3）歲，平均住院時間（12.5±3.2）d，其中自然咳痰法收集痰液標本99例，經支氣管鏡抽吸法收集痰液標本53例，根據細菌培養是否分離到肺炎克雷伯菌分為肺炎克雷伯菌組42例和非肺炎克雷伯菌組110例。本研究經我院醫學倫理委員會批準，并獲得家屬知情同意。

1.2 肺炎克雷伯菌培養鑒定

嚴格按照微生物痰液標本的采集及送檢標準進行樣本采集，采用PHOEN XTMl00全自動細菌分析儀對菌落進行鑒定。質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，購自衛生部臨床檢驗中心。

1.3 肺炎克雷伯菌核酸檢測

1.3.1 呼吸道病原菌核酸檢測? 試劑盒（圖1）購于北京博奧生物集團有限公司。本試劑盒采用微流控環介導等溫擴增技術，利用兩對特異性引物，在65℃恒溫下，快速完成DNA擴增。加入核酸反應產物檢測的熒光染料進行恒溫實時熒光分析。

1.3.2 痰液提取方法? 標本采集與處理：患者須在抗菌素治療前采集痰標本。①自然咳痰法：清晨第一口痰液為宜，勿混入唾液或鼻咽分泌物，②經支氣管鏡抽吸：纖維支氣管鏡對肺段和亞段進行灌洗，采集肺泡表面襯液，一般不少于5 mL，分別送檢細菌培養及微流控環介導等溫核酸檢測。用于環介導等溫檢測的標本白細胞數>25個/低倍視野，上皮細胞<10個/低倍視野。

1.3.3 樣本檢測? 痰液液化：痰標本轉移到密封容器，加入等體積的10% NaOH，渦旋混勻器震蕩混勻，37℃，液化30 min。核酸標本制備：取1 mL液化的樣品至1.5 mL離心管，4℃，離心半徑8 cm，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，加洗滌液混勻離心后棄上清，加入100 μL核酸提取液，混勻后轉移到核酸提取管，用核酸快速提取儀提取核酸，4℃，離心半徑8 cm，10 000 r/min，離心1～3 min備用。LAMP擴增反應體系：在標本制備區加入34.5 μL待測核酸樣品，20 μL LAMP擴增反應試劑，擴增反應總體系為54.5 μL。LAMP擴增反應：50 μL反應體系移入加樣口，反應：37℃，3 min;65℃，47 min。LAMP擴增檢測結果判斷：產物擴增曲線呈S形，快速擴增出現第一個峰值拐點時所對應的時間與原點時間差值為擴增熒光指數增加時間（Tp值），計算得到待檢物的陽性預測值，最低檢測限為5×102拷貝/反應。擴增肺炎克雷伯菌陽性標本的熒光歸一化曲線，見圖2，陽性內對照為人源標本的內質控，陽性外對照為無核酸模板的實驗質控。

圖2? ?微流控環介導等溫核酸擴增法檢測肺炎克雷伯菌陽性

熒光歸一化曲線

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，計數資料用百分率表示，兩種方法肺炎克雷伯菌檢出率間的比較采用配對資料的χ2檢驗。計算環介導等溫擴增法及其不同標本類型檢測方法的靈敏度、特異度、漏診率、誤診率、準確度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比，評價方法采用ROC曲線，計算曲線下面積和約登指數。實驗評價與一致性分析采用Kappa檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出情況

細菌培養檢出肺炎克雷伯菌陽性率為27.6%（42/152），微流控環介導等溫核酸檢測法陽性率為38.8%（59/152），后者陽性率高于前者，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。肺炎克雷伯菌組經微流控環介導等溫核酸擴增法檢出陽性菌37例，其中自然咳痰采集法21例，經支氣管鏡抽吸法16例，非肺炎克雷伯菌組檢出陽性菌22例，其中自然咳痰采集法15例，經支氣管鏡抽吸法7例。見表1。

表1? ?不同標本類型微流控環介導等溫擴增法檢測結果（例）

2.2 兩種方法檢測肺炎克雷伯菌方法性能評價

以細菌培養為標準檢測方法，微流控環介導等溫核酸擴增法的靈敏度、特異度、漏診率、誤診率、準確度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比分別為88.1%、80.0%、11.9%、20.0%、82.2%、62.7%、94.6%、4.4、0.15，ROC曲線見圖3，曲線下面積0.840，約登指數0.681。經支氣管鏡抽吸法和自然咳痰采集法檢測的評價見表2，ROC曲線見圖4（A、B）。

2.3 兩種方法的一致性分析

兩種方法的一致性分析評價Kappa值為0.604 > 0.600（P < 0.05），提示兩種檢測方法有較高的一致性。見表3。

3 討論

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的常見致病菌，是引起醫院感染的條件致病菌，可引起局部暴發流行。微流控技術結合了微電子、理化等技術，實現分子診斷技術中復雜分析過程的微型化、集成化、連續化檢測，可實現生物分子快速、大信息量的檢測[5-8]。微流控裝置搭載傳統PCR技術存在許多局限，如需手工微量移液操作[9];設計安裝微型閥和電極[10]增加設備研發成本;依賴昂貴的檢測儀器等[11]。LAMP技術能在等溫條件下實現一步擴增，由于針對靶基因設計了兩對特異引物，反應的靈敏度和特異性大大提升[12]。LAMP的這些優點規避了微流控技術的使用局限，而微流控技術也為LAMP核酸檢測系統提供了微量密閉反應空間，也使病原微生物床旁檢測（POCT）逐漸成為可能[13]。

本研究顯示微流控環介導等溫核酸擴增陽性率、靈敏度及特異性均較高，分別為38.8%、88.1%及80.0%、這與李松等[14]的研究結果相近。本研究中微流控環介導等溫核酸擴增檢出17例肺炎克雷伯菌培養陰性患者，說明存在痰培養陽性率低的可能，近一步的探討發現這些患者中有12例患者都曾接受過抗生素治療且治療效果明顯，分析原因可能是抗生素治療后細菌培養陽性率降低，影響了細菌培養鑒定的陽性率，而核酸檢測方法并未受影響，這與錢婧等[15]的研究一致。本研究所用的試劑盒最低檢測限為5×102拷貝/反應，檢出的陽性率為38.8%，高于傳統細菌培養鑒定方法的27.6%，具有一定的優勢，二者的臨床符合率較高（Kappa值0.604 > 0.600）。本研究對經支氣管鏡抽吸和自然咳痰法收集標本的檢測性能進行了比較，約登指數前者（0.694）高于后者（0.672），說明經支氣管鏡抽吸法獲取的臨床標本優于自然咳痰采集法。有研究[16]發現與傳統細菌培養比較，微流控環介導等溫核酸擴增法更容易檢測到混合菌株，原因可能為細菌培養鑒定中可挑選出優勢菌的單菌落進行鑒定，而核酸檢測的方法卻不能，因此對于核酸檢測的結果解釋仍應該結合患者情況具體分析。

近年來，隨著微流控環介導技術的不斷發展進步，各種便攜檢測設備也孕育而生，如手機等電子設備的加入將實現數據的實時傳輸和儲存[17]。微流控環介導等溫擴增集成診斷技術將使高質量、低成本的前沿診斷技術實現基層醫院的推廣，廣泛應用于醫、教、研領域[18-19]，如疾病監測和管理、病原體鑒定、醫源性感染的控制、環境監測、流行病學調查及遺傳病的檢測等[20]，為推動醫療技術的發展帶來新動力。

[參考文獻]

[1]? 林文慧，鄒秉杰，宋沁馨，等.多重環介導等溫擴增技術研究進展[J].遺傳，2015，37（9）：899-910.

[2]? Zhang C，Yao Y，Zhu JL，et al. Establishment and application of a real-time loop-mediated isothermal amplification system for the detection of CYP2C19 polymorphisms [J]. Sci Rep，2016，1（6）：26533.

[3]? 范菲楠，聶署萍，蕭曉友，等.微流控技術檢測宮頸脫落細胞HPV的臨床應用[J].臨床檢驗雜志：電子版，2018， 7（3）：375-377.

[4]? 黃世光，靳翔宇，林榮贊，等.微流控芯片核酸分析系統及其精準醫學應用[J].中國激光，2018，45（3）：124-131.

[5]? 王云超，牛海濤，李凱，等.微流控芯片特異性篩選膀胱癌循環腫瘤細胞的研究[J].中華泌尿外科雜志，2016，37（12）：936-939.

[6]? 鄒麗輝，李英，肖飛.微流控技術在臨床檢驗中的應用[J].中華檢驗醫學雜志，2018，41（9）：631-633.

[7]? Loo JF，Kwok HC，Leung CC，et al. Sample-to-answer on molecular diagnosis of bacterial infection using integrated lab—on—a—disc [J]. Biosens Bioelectron，2017，15（93）：212-219.

[8]? 沈韌，萬諒，賈艷偉.微流控技術在臨床檢測中的應用[J].分子診斷與治療雜志，2018，10（5）：289-294.

[9]? 徐歡，陳鳴.微流控生物傳感器及其分子診斷應用[J].中華檢驗醫學雜志，2018，41（9）：634-637.

[10]? Zhu Z，Tang Y，Jiang YS，et al. Strand-Exchange Nucleic Acid Circuitry with Enhanced Thermo-and Structure- Buffering Abilities Turns Gene Diagnostics Ultra-Reliable and Environmental Compatible [J]. Sci Rep，2016，4（6）：36 605.

[11]? 舒博文，林冬果，雷秀霞，等.微流控體外診斷技術應對臨床檢驗醫學的挑戰[J].中華檢驗醫學雜志，2018，41（9）：696-699.

[12]? Seyrig G，Stedtfeld RD，Tourlousse DM，et al. Selection of fluorescent DNA dyes for real-time LAMP with portable and simple optics [J]. Microbiol Methods，2015，11（119）：223-227.

[13]? Chaumpluk P，Plubcharoensook P，Prasongsuk S. Rapid detection of aflatoxigenic Aspergillus sp.in herbal specimens by a simple，bendable，paper-based lab-on-a-chip [J]. Biotechnol，2016，11（6）：768-779.

[14]? 李松，何曉光，馬可澤.環介導恒溫擴增芯片法在機械通氣新生兒下呼吸道病原菌檢測中應用[J].廣東醫科大學學報，2018，36（2）：169-172.

[15]? 錢婧，朱春梅，曹玲，呼吸道病原菌基因檢測法診斷兒童肺炎鏈球菌感染的臨床價值[J].中華全科醫學，2018， 16（9）：1512-1520.

[16]? Badolo A，Bando H，Traoré A，et al. Detection of G119S ace-1（R）mutation in field-collected Anopheles gambiae mosquitoes using allele-specific loop-mediatedisothermal amplification（AS-LAMP） method [J]. Malar J，2015， 14（1）：477.

[17]? Hsieh K，Ferguson BS，Eisenstein M，et al. Integrated electrochemical microsystems for genetic detection of pathogens at the point of care [J]. Acc Chem Res，2015， 48（4）：911-920.

[18]? 杜芳玲，王婷婷.環介導等溫擴增（LAMP）技術的研究進展與展望[J].實驗與檢驗醫學，2018，36（4）：509-512， 565.

[19]? 張亞平，鄭志高，簡保磊，等.新型環介導等溫擴增技術開發與應用研究進展[J].分子診斷與治療雜志，2018， 10（2）：138-144.

[20]? 溫福利.兔斯氏艾美耳球蟲環介導等溫擴增技術檢測方法的建立[J].實驗動物與比較醫學，2018，38（3）：176-181.

（收稿日期：2018-09-30? 本文編輯：封? ?華）