HPLC法測定獸用中藥散劑中非法添加苯丙酸諾龍的方法研究

吳昊 吳蕾 劉紅云

摘要 [目的]建立5種獸用中藥散劑中非法添加苯丙酸諾龍的高效液相色譜檢測方法。[方法]獸藥樣品經甲醇超聲提取后離心進行HPLC檢測分析。以乙腈-水為流動相，梯度洗脫，采用反相高效液相色譜-紫外檢測法進行測定，檢測波長為241 nm。[結果]苯丙酸諾龍的線性范圍是1.0～50.0 mg/L，回收率為89.7% ～102.5%，方法的檢測限為1.0 mg/kg，定量限為5.0 mg/kg。[結論]該方法的靈敏度高、精密度好、回收率高，適用于中獸藥中苯丙酸諾龍的快速檢測，為監管部門查處非法添加提供檢測依據。

關鍵詞 中獸藥;苯丙酸諾龍;高效液相色譜;非法添加

中圖分類號 S859.79文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0160-03

Abstract [Objective]This experiment established a method for determination of nandrolone phenylpropionate in 5 kinds of veterinary traditional Chinese drugs by HPLC.[Method] Veterinary powder samples were chosen and extracted by methanol，then detected by HPLC.Acetonitrile and water as mobile phase，gradient elute; determination by reversed-phase high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，the wavelength was 241 nm.[Result] The linear range of nandrolone phenylpropionate was 1.0 to 50.0 mg/L.The recovery rate was between 89.7% -102.5%，the limit of detection（LOD）was 1.0 mg/kg and the limit of quantitation（LOQ）was 5.0 mg/kg.[Conclusion]The method has high sensitivity，good precision and high recovery rate，and is suitable for rapid detection of phenylpropionate in Chinese veterinary medicine，and provides a test basis for the regulatory authorities to investigate and deal with illegal addition.

Key words Veterinary traditional Chinese medicine; Nandrolone phenylpropionate;High performance liquid chromatography; Illegal addition

苯丙酸諾龍是一種蛋白同化激素，是具有環戊烷并多氫菲母核的甾體激素類藥物，具有蛋白同化作用[1]，在醫學上用于嚴重創傷、燒傷后的修復、再生障礙性貧血的治療及骨質疏松癥的輔助治療，同時也具有促進畜禽生長、提高飼料轉化率、利于蛋白質沉積的作用。該試驗選取了5種中獸藥，有健胃散、肥豬散等，主要有催肥、開胃、主治生長遲緩等作用，若違規添加苯丙酸諾龍，利用其強的蛋白同化作用，可增強動物食欲和提高飼料轉化率，但食用此類殘留有苯丙酸諾龍的動物源性食品會造成男女性別特征的紊亂、總膽固醇升高、肝細胞癌、青少年兒童骨骼早閉后的身材矮小等，嚴重危害消費者身心健康。因此該試驗旨在建立中獸藥散劑中非法添加苯丙酸諾龍HPLC法的定性、定量檢查方法，為獸藥監管提供科學依據[2-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。美國Agilent公司高效液相色譜儀，型號1260-Ⅱ，配四元梯度泵、在線脫氣機、二極管陣列紫外檢測器（DAD）、自動進樣器和柱溫箱; 十萬分之一天平，德國賽多利斯，感量0.01 mg，型號BS21S;水浴超聲儀（HS10260D）;超純水機（Milli-Q? Millipore）;高速冷凍離心機（Hitachi CR 22G）。

1.1.2 主要試劑。

苯丙酸諾龍標準品（純度99.5%，批號100004-200603，中國食品藥品檢定研究院）;健胃散（石家莊九鼎動物藥業有限公司，批號17020329）;肥豬散（阜陽順昌牧業有限公司，批號20170901）;強壯散（安慶市柯曠動物藥業，批號170901）;壯陽散（合肥中龍神力動物藥業，批號20181218）;豬健散（亳州同欣生物科技有限公司，批號20161204）。甲醇、乙腈均為色譜純;試驗用水為超純水，符合GB/T 6682 用水規定。

1.1.3 溶液配制。

1.1.3.1 對照品溶液的制備。精密稱取苯丙酸諾龍對照品100 mg于100 mL 容量瓶，加甲醇溶解，制成濃度為1 000 mg/L的儲備液，精密量取儲備液5 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成工作液。

1.1.3.2 標準曲線工作液的制備。

精密量取“1.1.3.1”項下的儲備液，用甲醇依次稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 的標準品工作液。經0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱C18 150 mm×4.6 mm（eclipse Plus C18），粒徑5 μm，或者相當;柱溫35 ℃;流速1.0? mL/min;檢測波長241 nm;進樣量10 μL;流動相見表1。

1.2.2 標準曲線。將苯丙酸諾龍標準品工作液依次濃度從低到高，按上述色譜條件進樣，每個濃度重復3次，按其所得峰面積的平均值與對應的標準溶液濃度做標準曲線，計算回歸方程和相關系數。

1.2.3 樣品處理。準確稱取獸藥樣品2.0 g（精確至0.01 g），置于50? mL離心管中，準確加入25 mL甲醇，加塞，振蕩1 min;再置于超聲儀中超聲25 min，放冷，3 500 r/min 離心10 min。精密量取上清液1 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，溶液過0.45 μm 微孔有機濾膜，上機測定。

1.2.4 空白溶液的制備? 準確稱取經檢測不含陽性樣品的健胃散、肥豬散等樣品各2 g至50 mL離心管中，按“1.2.3”方法處理。

1.2.5 樣品回收率及精密度。準確稱取獸藥樣品各2.0 g，分別加入適量苯丙酸諾龍標準品工作液， 制成2.5、5.0、7.5? mg/kg 的3種質量濃度的陽性樣品， 按“1.2.3”方法進行處理，按“1.2.1”色譜條件進行測定，每個添加濃度做5個平行，計算平均回收率和精密度。

1.2.6 檢測限和定量限。在空白樣品中添加苯丙酸諾龍標準溶液， 測得其保留時間處的響應值與基線噪音值，計算信噪比，以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。

2 結果與分析

2.1 苯丙酸諾龍的液相色譜圖與保留時間 在選定的色譜條件下， 測得苯丙酸諾龍標準溶液的保留時間約為7.9 min，見圖1;各陽性添加樣品色譜圖見圖2～6，空白樣品色譜圖見圖7。

2.2 標準曲線 苯丙酸諾龍標準曲線見圖8，線性方程為y=30.024x+25.267， 其中y代表峰面積，x代表苯丙酸諾龍標準品溶液的濃度（mg/L），相關系數r=0.999 5，表明苯丙酸諾龍在1.0～50.0? mg/L線性關系良好。

2.3 樣品回收率和精密度 5種中獸藥樣品陽性添加平均回收率在89.7%～102.5%，RSD在2.3%～3.5%。表明該方法精密度良好。

2.4 檢測限和定量限 在信噪比大于3的情況下，苯丙酸諾龍的檢測限為1.0? mg/kg，在信噪比大于10 的情況下苯丙酸諾龍的定量限為5.0? mg/kg。

3 討論

3.1 樣品處理 苯丙酸諾龍極性小，脂溶性強，不溶于水，可溶于乙醇、甲醇、正己烷等有機溶劑。因此，該試驗在前處理中選擇了甲醇和乙腈為提取試劑，發現甲醇的提取效果較好，處理空白樣品時能較好地排除雜質對主峰的干擾。除提取溶劑的選擇外，該試驗還比較了處理步驟的不同，離心對樣品的影響，發現樣品經過超聲并離心后干擾清除更徹底，因此確定了超聲并離心的處理步驟。

3.2 流動相的選擇 如前所述，苯丙酸諾龍極性較小，出峰較遲，該試驗選用乙腈-水和甲醇-水2種流動相體系，采用不同比例做流動相，并參考其他文獻。試驗結果表明，采用乙腈-水作為流動相能把苯丙酸諾龍與飼料中的其他組分分離。當選擇乙腈-水比例75∶25為初始比例時，陽性添加樣品中的中藥成分出峰太多，對出峰時間為8 min左右的主峰干擾嚴重，因此直接提高有機相比例，確定初始比例乙腈-水為75∶25，并選擇表1中的梯度洗脫程序時，苯丙酸諾龍的保留時間適中，且與中獸藥樣品中的其他干擾雜質分離效果佳，峰型好。

4 結論

該試驗建立了高效液相色譜法測定5種中獸藥散劑中的苯丙酸諾龍含量的方法。試樣的前處理方法簡便、快速，方法的靈敏度高、精密度好、回收率高，適用于中獸藥中苯丙酸諾龍的快速檢測，為監管部門查處非法添加提供檢測依據。

參考文獻

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