S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯含量測定

余雙英 劉璐 張軍東

摘 要 建立氣相色譜法測定S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯的含量測定方法，并進行方法學驗證。該方法以正己烷為萃取劑，采用了聚乙二醇毛細管柱Agilent DB-WAX（30 m×0.53 mm×1 mm）、氫火焰離子化檢測器（FID）進行檢測。方法學驗證結果顯示，該方法專屬性良好，線性范圍為0.034 1～0.102 4 mg/ml；中間精密度所得相對標準偏差RSD僅為1.09%（n=12）；以80%、100%、120%濃度水平測定的平均回收率分別為99.38%、95.66%、99.13%，9組準確度溶液測得回收率的總平均值為98.06%（n=9），RSD為2.72%（n=9）。該方法專屬性較強，精密度、準確度、穩定性良好，可作為S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯的含量測定方法。

關鍵詞 氣相色譜 豬血漿 磷酸三丁酯 含量測定

中圖分類號：R927.11； R982 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）13-0065-03

Determination of the tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma by gas chromatography

YU Shuangying*， LIU Lu， ZHANG Jundong**

（ Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT A gas chromatography method for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma was established. Gas chromatography was performed using n-hexane as an extractant by a hydrogen flame ionization detector （FID） on an Agilent DB-WAX column （30 m×0.53 mm×1 mm）. The results of methodological verification showed that the method had good specificity with a linearity over the range of 0.034 1-0.102 4 mg/ml. The relative standard deviation （RSD） obtained from the intermediate precision was only 1.09% （n=12）. The average recovery rates from three samples at different concentrations （80%， 100%， 120%） were 99.38%， 95.66%， 99.13%， respectively. The total recovery rate was 98.06% （n=9） with RSD 2.72% （n=9）. This method has good specificity， precision， accuracy and stability and can be used for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma.

KEy WORDS gas chromatography； pig plasma； tributyl phosphate； content determination

豬源纖維蛋白黏合劑主要是由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應的溶解液組成的一種復合制劑，臨床常用于術中輔助止血[1]，生物相容性好、無毒無刺激，能有效黏附于創口起到良好的止血和促進創口愈合的作用[2-6]。為提高產品質量，降低該類產品傳播動物病毒的風險，本公司參照《血液制品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則》中“有機溶劑/去污劑（S/D）處理法”[1，7]對豬血漿進行病毒滅活，其中所用的有機溶劑為磷酸三丁酯。因此，在實際生產工藝中，為保證病毒滅活效果，提高終產品的臨床使用安全性，磷酸三丁酯的質量控制十分重要。

本方法主要參考中國藥典2015年版四部磷酸三丁酯殘留量測定法[8]，并適當進行了改進。其測定原理為：利用高氯酸將血漿中的蛋白進行沉淀，用正己烷萃取溶液中的磷酸三丁酯和磷酸三丙酯，離心，取上層清液，利用配置氫火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜儀測定磷酸三丁酯含量。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬血漿（公司自產，批號：20170207、20170209、20170210）；磷酸三丁酯和磷酸三丙酯（對照品，美國Sigma-Aldrich公司）；高氯酸和磷酸三丁酯（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；正己烷（HPLC級，海邁瑞爾化學技術有限公司）；聚山梨酯-80（藥用級，湖南華日制藥有限公司）。

1.2 儀器

7890B氣相色譜儀（美國Agilent公司）；ME104分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合器（Scientific Industries公司）；H1650臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發公司）。

1.3 色譜條件

Agilent DB-WAX聚乙二醇毛細管柱（30 m×0.53 mm×1 mm）；進樣口溫度190 ℃，無分流模式；進樣量1 ml；FID檢測器溫度210 ℃，空氣400 ml/min，氫氣40 ml/min，氮氣25 ml/min；于160 ℃運行15 min。

1.4 溶液及樣品配制

內標儲備液（400 mg/ml）：精密稱重磷酸三丙酯對照品40 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻。

對照品溶液：精密稱重磷酸三丁酯對照品60 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，混勻，即為對照品儲備液（600 mg/ml）。精密量取0.5 ml對照品儲備液、0.5 ml內標儲備液和3.5 ml正己烷，混勻，即得（STD溶液）。

樣品溶液：稱取一定質量的血漿于燒杯中，加入血漿質量比3%的聚山梨酯80，攪拌至完全溶解，再加入血漿質量比3%的磷酸三丁酯，混勻后，取6 ml于100 ml容量瓶中，用純化水定容，作為樣品儲備液（S/D滅活血漿）。準確量取0.5 ml樣品儲備液和0.1 ml高氯酸溶液（1.5 mol/L）于10 ml離心管中，振蕩混勻，于37℃水浴10 min，冷卻至室溫，再加入0.5 ml內標儲備液和4 ml正己烷，混勻后，3 000 r/min離心20 min，吸取上層清液進樣分析。

空白基質：同上配制不含磷酸三丁酯的空白基質溶液。

1.5 方法學驗證

1.5.1 專屬性

分別取按照1.4項下方法制備的對照品溶液（STD溶液）、空白基質和正己烷（空白溶液）適量于進樣瓶中，按照1.3項下色譜條件進樣分析?？瞻兹芤?、空白基質和對照品溶液色譜圖見圖1。

1.5.2 線性

精密量取對照品儲備液（600 mg/ml）0.75、0.60、0.5、0.4和0.25 ml于離心管中，再分別加入內標儲備液（400 mg/ml）0.5 ml和相應體積的正己烷，使得各線性溶液總體積均為4.5 ml，混勻后，按照1.3項下色譜條件各進樣1次。以各磷酸三丁酯對照品峰面積與內標峰面積比，對磷酸三丁酯對照品濃度作線性回歸，求得直線回歸方程。

1.5.3 準確度

取9支10 ml離心管，每3支為一組，分別加入0.25 ml樣品儲備液，再分別加入0.20 ml、0.25 ml、0.30 ml對照品儲備液，再各加入0.1 ml高氯酸溶液，振蕩混勻，置于37 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，加入0.5 ml內標儲備液和4 ml正己烷，混勻后，3 000 r/min離心20 min，取上層清液，按照1.3項下色譜條進樣分析，分別命名為R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3、R120%-1～R120%-3。

1.5.4 精密度（重復性/中間精密度）

在不同的日期，由兩位研究員分別按照1.4項下的樣品制備方法平行制備6份樣品溶液，并按照1.3項下色譜條件進樣分析，比較兩位研究員測定結果，并計算12組結果的RSD。

1.5.5 溶液穩定性

取樣品溶液和對照品溶液（STD溶液），放置在室溫條件下，以預定的時間間隔進樣分析，計算溶液在不同時間點和0時間點磷酸三丁酯含量的比值。

1.5.6 耐用性

固定其他色譜條件或樣品處理方法不變，實驗方法發生微小變動，如調整離心轉速為（3 000±500）r/min、調整柱溫為（160±2）℃、選用兩種不同批次的色譜柱、調整載氣流速為（8.0±0.2）ml/min，考察其耐用性。

2 結果

2.1 專屬性

空白溶液和空白基質在磷酸三丁酯峰的保留時間（約11.3 min）處均沒有干擾，內標物均出峰正常（約4.9 min），說明該方法專屬性良好（見圖1）。

2.2 線性

線性方程為y=25.829 3x-0.063 8，線性相關系數r=0.999 8，滿足接受標準（r≥0.990）。

2.3 準確度

3組不同濃度樣品的回收率分別為99.38%、95.66%、99.13%，9組樣品的總平均回收率為98.06%（n=9），RSD為2.72%（n=9），滿足接受標準（RSD≤5.0%）（表1）。

2.4 精密度（重復性/中間精密度）

兩位實驗員測得12份樣品中磷酸三丁酯含量的平均值為10.41 mg/ml，RSD為1.09%（n=12），結果滿足接受標準（RSD≤5.0%）（表2）。

2.5 溶液穩定性

對照品和樣品溶液于室溫放置48 h后，在各相應穩定性時間點磷酸三丁酯含量與0時間點測得含量的比值均在95.0%～105.0%之間，說明樣品和對照品穩定性良好（表3）。

2.6 耐用性

各參數微調后測得結果與正常條件下測得磷酸三丁酯含量的比值均在95.0%～105.0%，滿足接受標準（95.0%～105.0%），說明該方法耐用性良好（表4）。

2.7 樣品檢測

取3批豬血漿（批號：20170207、20170209、20170210），按照1.4項下樣品制備方法進行處理，并按照1.3項下色譜條件進樣分析，測定磷酸三丁酯含量分別為10.41、10.38和10.45 mg/ml。

3 討論

與藥典[8]和文獻方法[9-10]相比，本方法在樣品處理時增加了正己烷與供試品的體積比，可以提高磷酸三丁酯和磷酸三丙酯的萃取效率，并增大了離心轉速，可以使蛋白快速沉淀；數據處理方式上，藥典方法采用線性方程計算，本方法采用單點法計算，縮短了分析測定時間，從而可以提高工作效率。該方法專屬性強，準確度、精密度較好，可以用于測定S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯含量。

參考文獻

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