遺傳性血色病的實驗室診斷

鄭林文

【摘要】目的：探討遺傳性血色病的臨床特點，評價血清鐵指標、MRI、肝穿病理學檢查在遺傳性血色病診斷中的作用，并對遺傳性血色病的相關疾病基因HFE進行突變分析。方法：患者，女。因肝功異常就診，進行臨床、血清鐵指標、胸腹部MRI、病理組織學和特殊染色的觀察，并通過PCR及DNA序列測定等方法對與該病相關的HFE基因進行分析。結果：轉鐵蛋白飽和度、鐵蛋白異常;肝穿病理檢查，肝鐵沉積過多;胸腹部MRI顯示肝臟有金屬沉積;該病相關的HFE基因突變位點有待進一步查找。結論：遺傳性血色病患者在我國較少見，臨床特點不明顯，診斷困難，尤其是遺傳性血色病早期患者更難診斷，通過分子生物學方法診斷該病將變得更為重要。以上探討為該病的進一步研究奠定了基礎。

【關鍵詞】遺傳性血色病;HFE基因;MRI;肝臟;診斷

遺傳性血色病最先在1935年由Sheldon系統描述，其癥狀常在成年后才表現出來，且無特異性，診斷較困難。其診斷方法仍然主要依賴患者的臨床表現，包括臨床起病特點、多實質臟器功能損害的臨床表現等以及家族史、有無近親婚配史、遺傳方式、影像學檢查和機體鐵負荷程度檢測（尤其是血清轉鐵蛋白飽和度、鐵蛋白水平和肝鐵含量測定）。Feder等（1996）把遺傳性血色病基因限定在多態性位點D6S2238和D6S2241之間的240kb的范圍內，并在該區域內克隆了遺傳性血色病基因全長CDNA，鑒于遺傳性血色病基因與HLA家族基因具有較高的同源性，故把遺傳性血色病基因命名為HLA-H基因，且發現遺傳性血色病基因突變是本病患者發病的分子遺傳學基礎。患者通過臨床診斷為遺傳性血色病，為了找到該病的基因突變為點，根據文獻報道和研究發現HFE基因變異是遺傳性血色病的主要發病原因，故從HFE基因入手進行篩查。

1資料與方法

1.1一般資料

患者，女，22歲，有一妹17歲患糖尿病夭折，因肝功異常就診。從患者的臨床表現、影像學檢查、機體鐵負荷程度檢測（尤其是血清轉鐵蛋白飽和度、鐵蛋白水平和肝鐵含量測定）等各方面進行診斷。其皮膚黏膜色素有沉著，經鐵生化指標檢測、MRI及肝穿診斷為遺傳性血色病。

遺傳性血色病的診斷標準：

（1）排除引起繼發性血色病（溶血性貧血、多次大量輸血、慢性肝病等）的疾病;

（2）參照美國肝病學會關于遺傳性血色病診治指南的建議：存在遺傳性血色病的癥狀或體征，和（或）鐵生化指標異常;肝穿病理學檢查證實鐵的沉積或腹部磁共振（MRI）證實肝臟大量鐵沉積;

（3）結合遺傳病學家系調查。

1.2方法

（1）患者檢查血清鐵（SD、血清鐵蛋白（SF）、轉鐵蛋白飽和度（TS）、血常規、血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）和血糖。行肝穿病理學檢查，肝組織行HE染色，并做了腹部MRI、CT和彩色B超。

（2）采用碘化鉀法提取外周靜脈血白細胞DNA。設計6對PCR引物（上海生工公司合成），擴增HFE基因6個外顯子，PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃，30s;55℃，30s;72℃，30s;共35個循環，最后一個循環結束后繼續在72℃延伸5min。取PCR產物5u1在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，100伏電壓下電泳40分鐘后，用Fluor-S凝膠成像系統進行照相，看電泳條帶是否與預期大小相符。PCR產物按常規在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，此時應保證電泳緩沖液為新鮮配置的，100伏電壓下電泳40分鐘后，在紫外燈下切下含預期區帶的凝膠塊，用上海生工公司的膠回收試劑盒回收DNA。PCR產物純化后，以相應引物，委托上海生工公司在ABI PRISM 3730上進行DNA序列測定。

2結果

（1）患者血清鐵（SI）、血清鐵蛋白（SF）、轉鐵蛋白飽和度（TS）均偏高。

（2）肝臟穿刺術，肝臟病理回報：肝小葉結構局灶存在，局灶紊亂，肝細胞內可見大量大小不等的高密度脂褐素沉積，其中可見細小顆粒狀物質，有的顆粒彌漫分布，有的聚集成堆，有時可見單位膜包繞，脂褐素主要集中在毛細膽管附近，部分肝細胞脂滴存在，肝細胞核及其他細胞器無明顯異常竇間隙內及小葉間纖維組織增生無炎癥細胞浸潤。送檢的組織中間2個匯管區明顯增大，纖維組織增生，弓形纖維形成，少許炎癥細胞浸潤。結合臨床及電鏡超微結構特點診斷血色病伴肝纖維化。

（3）腹部MR/和彩色超聲診斷。

超聲所見：肝臟形態正常，左肝大小10.24x3.64cm，右肝肋間厚約11.56cm，實質回聲，肝門處探及多個實性偏低回聲區，較大約1.53x1.20cm，邊界清，膽囊，胰腺，脾臟正常。

超聲診斷：肝門處多發實性腫塊，考慮腫大淋巴結，肝、膽、胰、脾未見異常。

磁共振（上腹部）肝臟大小形態正常，左右肝比例正常，邊沿光整，肝內信號普遍下降，于T1WI及T2WI上均呈低信號尚均勻，增強掃描普遍無強化，肝門區有輕度片狀強化（此兩處強化可能為正常的肝島），提示有重金屬類沉積。

（4）腹部CT顯示肝臟有高密度物質沉積。

（5）瓊脂糖凝膠電泳分析片斷大小。

PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳時，出現特異性區帶分別為：El：300bp;E2：396bp;E3：500bp;E4：390bp;E5：348bp;E6：220bp，與預期大小相符

（6）序列比對分析結果。應用PCR及測序方法對一例遺傳性血色病家系先證者的HFE基因進行突變分析，在其HFE基因全長編碼區均未發現突變位點

3討論

遺傳性血色病在西方國家常見，近年來，隨著HFE基因、HJV基因、轉鐵蛋白受體2（TfR2）、膜鐵轉運蛋白（FPI）和鐵調素的相繼發現，遺傳性血色病的相關研究獲得突破性進展。遺傳性血色病可能在白種人中是最常見的常染色體隱性遺傳性疾病。以上資料結果顯示，該名患者應考慮遺傳性血色病的可能，一旦遺傳性血色病診斷明確，應詳細詢問家族史，及時行家系篩查，并爭取早發現、早診斷、早治療。遺傳性血色病采用的放血治療，并不為早期患者所接受。鐵螯合劑療效有限，毒性較大，價格貴。隨著人們對鐵代謝生理機制認識的深入。新型祛鐵藥物將會更好地為HHC患者服務。

分子診斷不僅可以確定患者的基因突變位點、突變類型、氨基酸改變情況和患者家系其他成員的基因型，還可以為遺傳咨詢、產前診斷提供依據。本研究從基因組DNA途徑入手，應用PCR及測序方法對一例遺傳性血色病家系先證者的HFE基因進行突變分析，在其HFE基因全長編碼區均未發現突變位點。進一步驗證了TsuiWM和Koyama C等人的觀點。根據國內外研究資料，還需要從其他的遺傳性血色病相關基因上去尋找突變位點。一定規模的HHC相關基因的調節也是迫切需要盡早開展的。這樣的研究可以使我們能較為清晰地了解我國HHC疾病的發生率及相關基因突變類型，有利于開展更為深入的治療學研究。