石斑魚有水活運工藝中溫度、鹽度的優化

吳 波，謝 晶*

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

石斑魚（Epinephelus）隸屬于鮨科（Serranidae），為暖水性魚類，主要養殖于我國海南、廣東、福建及浙江沿海地區，且養殖量占中國總養殖量95%，占世界石斑魚總養殖量的80%以上，并呈增長趨勢，供給國內外消費者[1-4]。石斑魚因其蛋白質含量高、脂肪含量低，且肉質細嫩、口感佳，而深得消費者青睞，具有較高的市場價值和消費需求，市場流通率高，因此石斑魚活體運輸技術尤為重要[5-6]。

為保證石斑魚活體運輸到達更多更遠的地方，多選擇有水活運，期間鮮活石斑魚常常會因為水體溫度、鹽度、氨氮、溶解氧含量等因素的變化而發生運輸應激，無論是輕度應激還是重度應激均會對魚體免疫功能、抗氧化功能、存活率產生不同程度的影響[7-8]。

在鮮活魚體有水活運過程中，溫度和鹽度作為基礎環境因子，亦是誘發運輸應激的主要應激源。過高或過低的溫度、鹽度會引發魚體應激反應，使魚體內環境失衡，影響其免疫功能。一般通過測定魚體血清中皮質醇、血糖含量變化來評價魚體發生應激反應的程度，進而評價魚類生理機體健康狀況[9-14]。除此以外，熱休克蛋白（heat shock proteins 70，HSP70）也是反映魚體受到應激反應程度的重要指標，從基因分子水平角度出發，當魚體受到應激源刺激時，HSP70的轉錄表達水平會發生改變，從而修復和降解改變或變性的蛋白，起到指示應激反應的作用[15-16]。

目前，國內外學者大多從免疫功能、抗氧化功能評價等角度研究了不同鮮活魚類有水運輸的最佳溫度、鹽度。范秀萍等[17]研究了溫度對石斑魚有水活運過程中代謝和魚肉品質的影響；王利娟等[18]研究了水溫對加州鱸魚保活運輸的影響；王雯等[19]研究了不同鹽度對斜帶石斑魚幼魚血清離子濃度和激素水平的影響。已有文獻大多是從溫度或是鹽度等單一影響因素進行保活工藝的研究，較少考慮溫度、鹽度對魚類有水活運的交互影響。本實驗以石斑魚為材料，采用響應面法研究溫度和鹽度的變化以及兩者之間的交互作用對石斑魚血清、肝中的皮質醇、血糖和HSP70的影響，優化石斑魚有水活運工藝，以獲得最佳的運輸水溫、鹽度條件。

1 材料與方法

1.1 材料

石斑魚（品種為珍珠龍膽石斑魚，俗稱老虎斑）購自上海市浦東新區蘆潮港，選取同一批體質健康無傷病，平均體長為（27.50±1.55）cm，平均體質量為（500±120）g，加水充氧運輸至實驗室。石斑魚購回后將其停食暫養于實驗室水族箱48 h，暫養和運輸密度均為2 kg/m3，水溫為27 ℃，鹽度為，空氣泵充氧，充氧速率為22 L/min，保證水中溶解氧含量不小于6 mg/L，pH 7.0，暫養期間每日50%換水。

1.2 儀器與設備

LX-100VTR模擬運輸振動臺 上海魯軒儀器設備廠；BS-200全自動生化分析儀 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；SH-1000Lab-全波長酶標儀 北京宏昌信科技有限公司；LP-20水族箱三合一曝氣機 深圳市興日生實業有限公司；F2640型多點溫度采集儀 美國Fluke公司；5810R高速冷凍離心機 上海艾測電子科技有限公司；HS 28A全自動循環水冷機 廣東海利集團。

1.3 方法

1.3.1 不同溫度下有水活運過程中石斑魚運輸應激的測定

將停食暫養后的石斑魚分為10、15、21、27 ℃和30 ℃共5 組，每組用魚20 條，分別置于5 個不同的120 L水族箱，以2 ℃/h降溫速率進行降溫直至相應溫度，實驗開始后將水族箱放置模擬振動臺上弱振，振動臺轉速為150 r/min，相當于陸路運輸中速率為20 km/h，并在運輸0、3、10、17、24、48 h觀察其存活率并取樣，取樣時采用一次性無菌注射器尾動脈抽血，靜置30 min，4 ℃、6 000 r/min離心15 min取其血清，放入－80 ℃冰箱保存；在無菌操作臺內用已消毒的剪刀和鑷子取其肝臟組織后放入－80 ℃冰箱保存，并盡快實驗防止RNA降解。

1.3.2 不同鹽度下有水活運過程中石斑魚運輸應激的測定

1.3.3 皮質醇質量濃度的測定

采用南京建成生物工程研究所的魚皮質醇ELISA試劑盒。

1.3.4 血糖濃度的測定

采用葡萄糖氧化酶法測定，以葡萄糖計。

1.3.5 HSP70相對表達量的測定

采用上海捷瑞動物總RNA快速提取試劑盒、TaKaRa反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒并進行熒光定量聚合酶鏈式反應，具體方法參考文獻[20]。

1.3.6 響應面試驗

通過以上實驗篩選出適宜石斑魚有水活運的溫度、鹽度范圍。采用二次通用旋轉組合設計，在用Design-Expert隨機編組時采用中心組合響應面法，研究溫度和鹽度對石斑魚運輸應激的聯合效應，其中，將血糖、皮質醇含量作為響應指標，試驗溫度范圍為15～27 ℃，鹽度范圍為10～30，將每個試驗因子進行水平編碼分別為－α、－1、0、1、α（|α|=1.414）。試驗采用2因素5水平，由系統將溫度和鹽度隨機交叉組合形成13 組試驗，其中，中心點重復5 次，試驗平行測定3 次，每組試驗樣本數量為10 尾，運輸水溫度、鹽度根據軟件設計進行設定，其余暫養及運輸水條件參考1.1節，運輸方式及取樣方式參考1.3.1節，在運輸24 h時取其血清用以血糖、皮質醇的測定。

1.4 數據處理

采用Origin Pro 2016、SPSS 21.0、Design-Expert 8.06等軟件進行數據分析處理。其中，響應面試驗數據結果以 ±s表示。通過Design-Expert 8.06軟件建立二次回歸方程模型為：

式中：Y為響應變量（皮質醇、血糖）；T為溫度；S為鹽度；b0為回歸常數；b1、b2分別為溫度、鹽度一次效應系數；b3為溫度、鹽度互作效應系數；b4、b5為溫度、鹽度二次效應系數。

2 結果與分析

2.1 溫度對運輸過程中石斑魚運輸應激及存活率的影響

2.1.1 溫度對運輸過程中石斑魚存活率的影響

表1 石斑魚在不同溫度與保活時間下的存活率Table 1 Survival rates of grouper at different temperatures and transportation times

溫度是石斑魚有水活運工藝的關鍵環境因子，嚴格控制運輸水溫度是有水保活工藝研究的基礎，外界溫度的波動會直接影響魚體生理變化，影響魚體的代謝速率，從而損傷機體，嚴重時會導致魚體死亡，直接影響其存活率。如表1所示，運輸溫度為10 ℃時，石斑魚有水活運開始后出現死亡，運輸時長僅為3 h，過低的溫度無法使魚體進入正常休眠狀態，屬于不可接受溫度范圍，造成機體不可逆損傷直至死亡；運輸溫度為30 ℃時，石斑魚有水活運48 h時存活率僅為50%，且運輸72 h時全部死亡，過高的溫度使魚體處于生命活動旺盛期，促進代謝的同時會增加水體氨氮含量不適宜魚體長時間存活，且旺盛的生命活動伴以模擬運輸會給魚體帶來劇烈機體碰撞導致嚴重的機械損傷，因此，10 ℃和30 ℃均不適用作為石斑魚有水活運水溫；運輸溫度為15、21 ℃和27 ℃時，石斑魚有水活運至少可維持72 h，且在運輸48 h后存活率均高達95%以上，適宜作為石斑魚有水活運工藝研究的水溫范圍；綜上，石斑魚有水活運工藝研究的溫度范圍選擇15～27 ℃。宋志明[21]研究了溫度對暖水性魚類點籃子魚幼魚生長和代謝的影響，表明溫度在19～31 ℃范圍內，其存活率均達到95%以上，與本研究結論相近。

2.1.2 溫度對運輸過程中石斑魚血清皮質醇含量的影響

圖1 溫度對有水活運過程中石斑魚血清皮質醇含量的影響Fig. 1 Effect of water temperatures on serum cortisol concentration of grouper during water transportation

皮質醇是反映魚體應激的指示性指標，當魚體發生應激反應時，會引起各項激素水平變化，而皮質醇則是反應鏈中分泌的最后一種激素，隨著應激強度的增大，皮質醇含量也會不同程度上升[22]。如圖1所示，15、21、27 ℃和30 ℃組石斑魚血清皮質醇含量均呈先上升后下降的趨勢，并在運輸3 h時達到最大，且在該點30 ℃組石斑魚血清皮質醇含量顯著高于其余3 組（P＜0.05），說明高溫使石斑魚產生了劇烈的應激反應，分泌大量皮質醇，不適宜作為石斑魚有水活運工藝的溫度范圍，在運輸剛開始時，魚體無法及時適應運輸振動帶來的刺激，均產生了不同程度的應激反應導致皮質醇含量上升；15 ℃組石斑魚血清皮質醇含量顯著低于其余3 組（P＜0.05），低溫使石斑魚處于半休眠狀態，其新陳代謝活動、分泌激素能力均比其余組石斑魚弱；21 ℃組與27 ℃組介于其余2 組之間，總體而言，隨著溫度降低，皮質醇含量呈下降的趨勢，由此，石斑魚有水活運較適宜的溫度范圍為15～27 ℃。邵彥翔等[23]以雜交石斑魚為實驗對象，研究高溫突變對其血清指標產生的影響，研究結果同樣顯示高溫脅迫下的雜交石斑魚與對照組相比皮質醇含量顯著升高。

2.1.3 溫度對運輸過程中石斑魚血糖濃度的影響

應激反應發生，生命活動劇烈、新陳代謝旺盛會使魚體血糖濃度上升，當應激反應持續時間延長，魚體不斷消耗能量，則魚體內的血糖被不斷分解用以能量的供給[24-25]，因而血糖濃度亦是魚類應激反應的指示性指標。如圖2所示，4 組不同溫度運輸組魚體內血糖濃度均呈先上升后下降的趨勢，并在運輸10 h時血糖濃度達到最大，在該點15 ℃組魚體血糖濃度顯著低于其余3 組（P＜0.05），而30 ℃組魚體血糖濃度顯著高于其余3 組（P＜0.05），說明應激反應劇烈不適宜運輸，在活魚運輸初期因魚體需適應模擬運輸振動產生不同程度的應激反應，因15 ℃組的魚體為休眠狀態，其生命活動遠少于其余組，則應激反應較弱，相反，30 ℃組魚體生命活動過多導致應激反應劇烈。總體而言，魚體血糖濃度變化速率隨溫度降低而減緩，差異顯著（P＜0.05），說明應激反應程度隨著溫度降低而得到緩解，因此，石斑魚有水活運較適宜的溫度范圍為15～27 ℃。Pilinkovskij等[26]研究運輸脅迫對大西洋鱘血清指標產生的影響，研究結果顯示運輸脅迫會使魚體內血糖水平顯著升高且與對照組差異顯著。

2.1.4 溫度對運輸過程中石斑魚HSP70表達量的影響

圖3 溫度對有水活運過程中石斑魚HSP70表達量的影響Fig. 3 Effect of water temperature on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation

HSP70是應激時常被研究的指示性指標，它能促進新生多肽鏈的折疊，并促進變異或變性的蛋白質修復和降解。在魚類中，當魚體發生應激反應時會促進HSP70轉錄，HSP70水平的升高有助于保護細胞免受應激源刺激損傷，從而保護機體免受損傷，提高魚體存活率[27]。如圖3所示，4 組不同運輸溫度組石斑魚肝臟HSP70轉錄水平隨著運輸時間的延長呈先上升后下降的趨勢；30 ℃運輸組，石斑魚肝臟HSP70轉錄水平整體顯著高于其余3 組，且17 h后HSP70轉錄水平逐漸恢復但并未恢復到初始水平，說明應激反應對肝臟造成了不可逆的損傷，因此不適宜用于石斑魚有水活運工藝的溫度；而15、21 ℃和27 ℃運輸組HSP70轉錄水平均可逐步恢復至初始狀態，說明肝臟損傷可修復。實驗過程中因魚體處于模擬運輸狀態，溫度的差異、振動的影響均會使魚體產生不同程度的應激反應，15 ℃組因其魚體進入休眠狀態而減少生命活動降低代謝速率，30 ℃組使魚體處于超適宜生存溫度，促進其代謝，不僅使運輸水質進一步惡化，劇烈的應激反應往往會造成不可逆損傷。羅勝玉等[28]研究顯示溫度的突變會誘發魚體發生應激反應，引發HSP70蛋白含量激增，隨著脅迫時間延長，其含量可恢復至初始狀態。

2.2 鹽度對運輸過程中石斑魚運輸應激及存活率的影響

2.2.1 鹽度對運輸過程中石斑魚存活率的影響

表2 石斑魚在不同鹽度與保活時間下的存活率Table 2 Survival rates of grouper at different salinities and transportation times

2.2.2 鹽度對運輸過程中石斑魚血清皮質醇含量的影響

如圖4所示，4 組不同鹽度運輸水組的石斑魚血清皮質醇含量均呈先上升后下降的趨勢且在運輸3 h時達到最高，且40組石斑魚血清皮質醇整體水平顯著高于其余3 組（P＜0.05），說明其應激反應強烈，該鹽度水平不適于石斑魚有水活運工藝，過高的鹽度使魚體生存過程中無法適應，機體內環境失衡，通過劇烈的應激反應進行自身調節，長時間抗應激反應造成不可逆損傷；3 個不同鹽度組石斑魚的血清皮質醇整體水平隨鹽度的增加而降低，說明高鹽度組的魚體應激水平顯著低于低鹽度組（P＜0.05），因此，石斑魚有水活運適宜的運輸水鹽度范圍為10～ 30。王雯等[19]研究了斜帶石斑魚幼魚在不同鹽度下血清離子濃度和激素水平的變化，結果顯示5‰和10鹽度組魚體血清皮質醇水平顯著高于20鹽度組，與本實驗結果一致。

圖4 鹽度對有水活運過程中石斑魚血清皮質醇含量的影響Fig. 4 Effect of salinity on serum cortisol level of grouper during transportation

2.2.3 鹽度對運輸過程中石斑魚血糖濃度的影響

圖5 鹽度對有水活運過程中石斑魚血糖濃度的影響Fig. 5 Effect of salinity on blood glucose level of grouper during transportation

由圖5可知，石斑魚有水活運過程中魚體血糖濃度均隨運輸時間的延長呈先上升后下降的趨勢，40組魚體血糖濃度整體顯著高于其余3 組（P＜0.05），且變化速率快，不利于石斑魚中長途運輸；20組魚體血糖濃度整體顯著低于其余3 組（P＜0.05），且變化速率緩慢，變化不明顯，說明低鹽度組石斑魚應激反應較弱，適宜中長途運輸。10～30可作為石斑魚有水活運工藝鹽度范圍。不同鹽度水環境使魚體產生不同程度應激反應，過高鹽度使魚體產生劇烈應激反應，在其抗應激過程中需大量血糖分解以供給能量，血糖濃度變化速率快，抗應激強度大。徐鋼春等[13]研究了鹽度對刀鱭運輸應激指標的影響，結果顯示運輸應激導致魚體血糖濃度上升，且加鹽組魚體血糖濃度隨運輸時間的延長趨于平穩，適宜的鹽度可降低魚體應激反應。

2.2.4 鹽度對運輸過程中石斑魚HSP70表達量的影響

圖6 鹽度對有水活運過程中石斑魚HSP70表達量的影響Fig. 6 Effect of salinity on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation

如圖6所示，4 組不同鹽度處理下的運輸組，石斑魚肝臟HSP70表達量均隨運輸時間的延長呈先上升后下降的趨勢，且隨著鹽度的升高，HSP70表達量逐漸降低。40‰運輸組整體HSP70表達量顯著高于其余3 組（P＜0.05），且最終并未恢復至初始狀態，表明石斑魚肝臟受到不可逆的機體損傷；而10、20、 30運輸組石斑魚肝臟HSP70表達量隨運輸時間延長逐漸下降可恢復至初始水平，說明石斑魚在有水活運過程中肝臟受損可修復。由于石斑魚肝臟HSP70表達量隨著鹽度的增大呈下降趨勢，兩者呈線性關系，并不適合在后續實驗中作為響應面試驗設計的響應值。30鹽度更適于石斑魚有水活運。

2.3 響應面試驗結果及方差分析

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

根據Design-Expert 8.0軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合，得到血糖、皮質醇對溫度（T）和鹽度（S）的二次多項回歸方程分別為：

血糖=－30.129 99＋2.763 55T＋0.485 91S－0.040 000TS－0.038 628T2＋1.968 75S2

皮質醇=－261.841 42＋24.049 85T＋4.352 06S－3.625 7TS－3.277 5T2＋0.019 056S2

表4 溫度和鹽度對運輸過程中石斑魚血糖濃度影響的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on blood glucose level of grouper during transportation

表5 溫度和鹽度對運輸過程中石斑魚皮質醇含量影響的回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on serum cortisol levelof grouper during transportation

如表4、5所示，建立的模型P值均小于0.000 1，極顯著（P＜0.01），說明建立的模型有效。失擬項F值分別為6.38、5.39，表明擬合方程有效，且方程的決定系數分別為0.976 6、0.975 5，校正系數分別為0.959 9、0.958 0，說明2 個方程擬合度均極高，所選模型準確。一次項、交互相回歸系數均極顯著，說明溫度、鹽度以及交互作用對有水活運過程中石斑魚血糖、皮質醇有極其顯著的影響；二次項T2回歸系數極顯著，說明溫度的二次效應對有水活運過程中石斑魚血糖、皮質醇影響極其顯著；二次項S2回歸系數不顯著，表明鹽度的二次效應對有水活運過程中石斑魚血糖、皮質醇基本無影響。

2.4 響應面分析

圖7 溫度和鹽度對有水活運過程中石斑魚血糖濃度（a）、皮質醇質量濃度（b）影響的響應面圖Fig. 7 Response surface plots showing the effect of temperature and salinity on blood glucose concentration (a) and serum cortisol concentration (b) of grouper during transportation

如圖7所示，2 個曲面較陡，說明溫度和鹽度對血糖濃度、皮質醇含量的交互作用明顯，當鹽度一定時，石斑魚血糖濃度、皮質醇含量均隨溫度升高呈先升高后下降的趨勢；當溫度一定時，兩者隨著鹽度的升高呈下降趨勢。

2.5 優化工藝的確定和驗證實驗

綜上可知，根據響應面軟件分析篩選得出，石斑魚有水活運工藝最優溫度16.76 ℃、鹽度26，在該試驗條件下石斑魚血清皮質醇質量濃度為16.44 ng/L，血糖濃度為1.83 mmol/L。根據實際可操作性，將其修正為：溫度16 ℃、鹽度26。在修正的優化條件下進行實驗驗證，平行測定3 次，得到的石斑魚血清皮質醇質量濃度為（15.83±1.07）ng/L，血糖濃度為（1.93±0.17）mmol/L，經過t檢驗分析發現實際值均與預測值比較接近，說明響應面法獲得的石斑魚有水活運優化工藝是準確、可行的。

3 結 論

石斑魚有水活運過程中，溫度和鹽度的變化均使石斑魚產生應激反應從而影響其存活率、血清皮質醇質量濃度、血糖濃度以及肝臟HSP70表達量。由溫度、鹽度實驗分別得出石斑魚有水活運工藝溫度范圍為15～27 ℃、鹽度范圍10～ 30。通過響應面法優化石斑魚有水活運工藝，得到石斑魚有水活運最佳溫度為16 ℃，鹽度為26，在此條件下，石斑魚血清皮質醇為（15.83±1.07）ng/L，血糖濃度為（1.93±0.17）mmol/L，為推薦的有水活運工藝。