二氫槲皮素對局灶性腦缺血損傷模型大鼠血液流變學等相關指標的影響

顧媛媛 姜波 田明 韓玉生 劉　旭 尚艷琦 梁　慧 董曉紅 代巧妹 周忠光

摘 要 目的：觀察二氫槲皮素（DHQ）對局灶性腦缺血損傷模型大鼠血液流變學等相關指標的影響。方法：將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組（陽性對照，20 mg/kg）和DHQ低、中、高劑量組（15、30、60 mg/kg），每組10只。各給藥組大鼠均灌胃相應藥物，假手術組大鼠灌胃等體積0.4%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續14 d。末次給藥后，除假手術組外的其余各組大鼠均采用傳統雙側頸總動脈結扎法復制局灶性腦缺血損傷模型。缺血24 h后，觀察各組大鼠腦組織病理學變化，并檢測其血液流變學指標[全血黏度（低、中、高切）、全血還原黏度（低、中、高切）、血漿黏度]、紅細胞參數[紅細胞壓積、紅細胞聚集指數（EAI）、紅細胞變性指數（DI）、紅細胞剛性指數（IR）]、凝血功能指標[活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）、血漿纖維蛋白原（FIB）]水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織細胞疏松，間隙明顯，缺血區周圍神經元損傷明顯，且全血黏度、全血還原黏度、血漿黏度、紅細胞壓積、EAI、IR、FIB水平均顯著升高，DI、APTT、PT、TT均顯著降低或縮短（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善，且尼莫地平組大鼠全血黏度、血漿黏度、EAI、IR，DHQ高劑量組大鼠全血黏度、紅細胞積壓，DHQ各劑量組大鼠血漿黏度、EAI，DHQ中、高劑量組大鼠IR均顯著降低；尼莫地平組大鼠DI、APTT、PT、TT，DHQ各劑量組大鼠DI、APTT、TT，DHQ高劑量組大鼠PT均顯著升高或延長（P<0.05或P<0.01）。而其余指標組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：DHQ對局灶性腦缺血損傷模型大鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與改善其血液流變學指標以及凝血功能異常有關。

關鍵詞 二氫槲皮素；血液流變學；紅細胞參數；凝血功能；局灶性腦缺血損傷模型；大鼠

Effects of Dihydroquercetin on Hemorheology and Other Relevant Indexes in Local Cerebral Ischemic Injury Model Rats

GU Yuanyuan1，JIANG Bo2，TIAN Ming3，HAN Yusheng3，LIU Xu3，SHANG Yanqi4，LIANG Hui4，DONG Xiaohong5，DAI Qiaomei4，ZHOU Zhongguang1（1. Institute of Traditional Chinese Medicine， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China； 2. Center for Drug Safety Evaluation， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China； 3. Teaching Experiment Center， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China； 4. Basic Medical College， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China； 5. Jiamusi College， Heilongjiang University of TCM， Heilongjiang Jiamusi 154007， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the effects of dihydroquercetin （DHQ） on hemorheology and other relevant related indexes in local cerebral ischemic injury model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， nimodipine group （positive control， 20 mg/kg） and DHQ low-dose， medium-dose and high-dose groups （15， 30， 60 mg/kg）， with 10 rats in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically， sham operation group and model group were given constant volume of 0.4% Sodium carboxymethyl cellulose solution， once a day， for consecutive 14 d. After last administration， local cerebral ischemic injury model was induced by bilateral common carotid artery ligation in other groups except for sham operation group. After 24 h of cerebral ischemia， histopathological changes of brain tissue in rats of each group were observed； the levels of hemorheology indexes [whole blood viscosity （low， medium and high shear）， whole blood reduced viscosity （low， medium and high shear）， plasma viscosity]， erythrocyte parameters （hematocrit， EAI， DI， IR）， coagulation function indexes （APTT， PT， TT， FIB） were detected. RESULTS： Compared with sham operation group， the cells in the brain tissue of model group were loose， the gap was obvious， and the neurons around the ischemic area were damaged obviously； the levels of whole blood viscosity， whole blood reduced viscosity， plasma viscosity， hematocrit， EAI， IR and FIB were increased significantly， while the levels of DI， APTT， PT and TT were decreased or shortened significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above symptoms of administration groups were improved to different extents， whole blood viscosity， plasma viscosity， EAI and IR of nimodipine group， whole blood viscosity and hematocrit of DHQ high-dose group， plasma viscosity and EAI of DHQ groups， and IR of DHQ medium-dose and high-dose groups were decreased significantly； DI， APTT， PT and TT of nimodipine group， DI， APTT and TT of DHQ groups and PT of DHQ high-dose group were increased or prolonged significantly （P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in other indexes among those groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： DHQ can protect against local cerebral ischemic injury model rats， the mechanism of which may be associated with improving hemorheology indexes and coagulation function disorder.

KEYWORDS Dihydroquercetin； Hemorheology； Erythrocyte parameters； Coagulation function； Local cerebral ischemia injury model； Rats

腦血管疾病是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，具有較高的致殘率和致死率，其中缺血性腦卒中是患者死亡的主要原因之一[1]。缺血性腦病的病理機制十分復雜，有研究證實血液流變學異常是腦缺血損傷的重要病理機制之一[2]。二氫槲皮素（DHQ）是廣泛存在于自然界中的一種重要的二氫黃酮醇類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、擴張冠狀動脈等多種生物活性[3-5]。據國內外文獻報道，DHQ還具有抗炎、抗過敏、治療心腦血管疾病的作用[6-8]。離體研究表明，DHQ除可抑制血小板聚集外，還可增強α-硫辛酸的抗血小板聚集活性，有助于降低心腦血管疾病的發生風險[9]。但DHQ是否能改善腦缺血后血液流變學和凝血功能異常尚未見相關文獻報道。為此，本研究通過復制局灶性腦缺血損傷大鼠模型，觀察DHQ對大鼠血液流變學和凝血功能等相關指標的影響，初步探討DHQ對腦缺血損傷的保護作用及可能機制，以期為DHQ的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LBY-N7500B型全自動血液流變儀、C2000-A型全自動血凝儀（北京普利生儀器有限公司）；XS-500i型全自動血細胞分析儀[希森美康醫用電子（上海）有限公司]；CPA225D型電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；KDC-160R型高速冰凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；2235型石蠟組織切片機（德國Leica公司）；TE2000-E型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

DHQ對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z07M6B1，純度：≥98%）；尼莫地平片（陽性對照，拜耳醫藥保健有限公司，批號：BJ36637，規格：30 mg）；注射用青霉素鈉[哈藥集團制藥總廠，批號：16010906-2；規格：按C16H17N2NaO4S計0.48 g（80萬單位）]；活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒（凝固法）（批號：173203012）、凝血酶原時間（PT）測定試劑盒（凝固法）（批號：175202021）、凝血酶時間（TT）測定試劑盒（凝固法）（批號：172902011）、纖維蛋白原（FIB）測定試劑盒（凝固法）（批號：172804011）均由北京普利生儀器有限公司提供；蘇木精染色液（批號：20160308）、伊紅染色液（批號：20160308）均由上海惠世生化試劑有限公司提供；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

清潔級健康SD大鼠60只，雌雄各半，8～10周齡，體質量（250±10）g，由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心（GLP）提供[動物生產許可證號：SCXK（黑）2013- 004]。所有大鼠均適應性喂養1周。

2 方法

2.1 分組與給藥

將SD大鼠隨機分為6組，即假手術組、模型組、尼莫地平組（20 mg/kg，參考文獻[10]并按成人臨床給藥劑量換算而得；以0.4%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑）以及DHQ低、中、高劑量組（15、30、60 mg/kg，參考文獻[11]及本課題組前期預實驗結果；以0.4%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑），每組10只。各給藥組大鼠均灌胃相應藥物（2 mL/kg），假手術組和模型組大鼠均灌胃等體積0.4%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續14 d。

2.2 造模

連續給藥14 d后，采用傳統雙側頸總動脈結扎法復制局灶性腦缺血損傷模型[12]。末次給藥后，所有大鼠均禁食、不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉（下同），以仰臥位固定于手術臺上，頸部備皮消毒，沿頸部中線切開，采用鈍性剝離方法分離皮下筋膜及肌肉組織，充分暴露雙側頸總動脈，用非吸收性外科縫合線結扎雙側頸總動脈，使其血流被完全阻斷；予注射用青霉素鈉適量消炎后縫合傷口，于37 ℃下保溫至蘇醒。假手術組大鼠僅分離雙側頸總動脈而不結扎，其余操作同上。

2.3 腦組織病理學觀察

造模缺血24 h后，將大鼠同法麻醉，經腹主動脈采血后斷頭取腦。將腦固定于10%中性福爾馬林中，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，常規切片（厚度約5 μm），經蘇木精-伊紅（HE）染色后，置于倒置顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理結構變化。

2.4 血液流變學相關指標和紅細胞參數檢測

取“2.3”項下血液樣品適量，采用全自動血液流變儀檢測各組大鼠全血黏度（低切、中切、高切）和全血還原黏度（低切、中切、高切）。取“2.3”項下血液樣品適量，經肝素鈉抗凝后，以3 000 r/min離心10 min，分離血漿，采用全自動血液流變儀檢測各組大鼠血漿黏度，采用全自動血細胞分析儀檢測各組大鼠紅細胞壓積、紅細胞聚集指數（EAI）、紅細胞剛性指數（IR）、紅細胞變性指數（DI）等紅細胞參數。

2.5 凝血功能相關指標檢測

取“2.3”項下血液樣品適量，經枸櫞酸鈉抗凝后，以3 000 r/min離心15 min，分離血漿，在3 h內采用全自動血凝儀檢測各組大鼠APTT、PT、TT和FIB水平。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以 x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 DHQ對局灶性腦缺血損傷模型大鼠腦組織形態學的影響

假手術組大鼠腦組織未見水腫、缺血等病變。模型組大鼠腦組織細胞疏松，間隙明顯，缺血區周圍神經元損傷明顯且形狀不規則，僅見固縮的細胞核。尼莫地平組和DHQ各劑量組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善，其中尼莫地平組和DHQ中、高劑量組較為明顯，詳見圖1。

3.2 DHQ對局灶性腦缺血損傷模型大鼠血液流變學相關指標的影響

與假手術組比較，模型組大鼠全血黏度、全血還原黏度、血漿黏度均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組大鼠全血黏度、血漿黏度，DHQ高劑量組大鼠全血黏度以及DHQ各劑量組大鼠血漿黏度均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；而DHQ低、中劑量組大鼠全血黏度，尼莫地平組和DHQ各劑量組大鼠全血還原黏度與模型組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表1。

3.3 DHQ對局灶性腦缺血損傷模型大鼠紅細胞參數的影響

與假手術組比較，模型組大鼠紅細胞積壓、EAI、IR均顯著升高，DI顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組大鼠EAI、IR，DHQ高劑量組大鼠紅細胞壓積，DHQ各劑量組大鼠EAI以及DHQ中、高劑量組大鼠IR均顯著下降；尼莫地平組和DHQ各劑量組大鼠DI均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；而尼莫地平組和DHQ低、中劑量組大鼠紅細胞壓積，DHQ低劑量組大鼠IR與模型組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.4 DHQ對局灶性腦缺血損傷模型大鼠凝血功能相關指標的影響

與假手術組比較，模型組大鼠APTT、PT、TT均顯著縮短，FIB水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組大鼠APTT、PT、TT，DHQ各劑量組大鼠APTT、TT以及DHQ高劑量組PT均顯著延長，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；而DHQ低、中劑量組大鼠PT以及尼莫地平組和DHQ各劑量組大鼠FIB水平與模型組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表3。

4 討論

血液流變學是研究血液流變及血細胞變形規律的一門分析學科，其主要內容是研究血液的流動性和黏滯性以及紅細胞的聚集性和變形性等。血液流變學異常、血液高凝或血流緩慢均可導致血栓的形成，而血栓則是腦梗死、心肌梗死等心腦血管疾病的危險因素之一[1]。

全血（還原）黏度是血液流變學的重要檢測指標之一，也是反映血液黏稠度的主要指標：低切速率（1/10 s-1）下的全血黏度值可反映紅細胞的聚集程度（即低切黏度值越高，紅細胞的聚集程度就越高）；而高切速率（1/200 s-1）下的全血黏度值可反映紅細胞的變形程度（即高切黏度值越高，紅細胞的變形性就越差）[13]。血漿黏度是反映生物大分子（如纖維蛋白原、球蛋白等）對血細胞黏度影響的重要指標[14]。血液流變學指標（如全血黏度等）及紅細胞參數（如紅細胞壓積等）的變化則是導致血液黏度增加的主要原因，而血液黏度的增加則可能導致血液濃厚、黏稠、凝固和聚集，使腦血流量減少，進一步促進血栓的形成[15]。缺血性腦病主要發病機制之一是由于血液的凝聚性及黏度增加或者血流動力學改變導致患者腦內局部動脈供血不足，發生急性腦缺血、缺氧、壞死等嚴重損傷[16]。因此，改善患者的血流變學具有重要的臨床指導意義。凝血4項（APTT、PT、TT、FIB）能有效反映機體的凝血功能。其中，APTT和PT主要反映內源性及外源性凝血系統的狀況[17-18]；TT則主要反映FIB轉化為纖維蛋白所需的時間；FIB是促進血小板聚集最主要的血液蛋白，可引起血液黏度和血液流變學改變。由此可見，凝血4項的檢測對評估腦梗死患者病情的變化、提高其早期診斷的準確率均具有重要的意義。

為探討DHQ對腦缺血損傷的保護作用及可能機制，本研究復制了局灶性腦缺血損傷大鼠模型，以尼莫地平為陽性對照（尼莫地平是臨床治療腦缺血疾病的常用藥物，可透過血腦屏障而作用于腦部血管，通過降低腦部血管阻力指數、增加腦部供血及供氧來降低腦部組織的損傷程度[19]），考察了DHQ對大鼠腦組織形態學、血液流變學相關指標、紅細胞參數及凝血功能相關指標的影響。結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織細胞疏松，間隙明顯，缺血區周圍神經元損傷明顯，且全血（還原）黏度、血漿黏度、紅細胞壓積、EAI、IR、FIB水平均顯著升高，DI、APTT、PT、TT均顯著降低或縮短，差異均有統計學意義。這表明大鼠血液流變學發生明顯改變，其凝血功能受到抑制，提示模型復制成功。與模型組比較，各給藥組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善，且尼莫地平組大鼠全血黏度、血漿黏度、EAI、IR，DHQ高劑量組大鼠全血黏度、紅細胞積壓，DHQ各劑量組大鼠血漿黏度、EAI，DHQ中、高劑量組大鼠IR均顯著降低；尼莫地平組大鼠DI、APTT、PT、TT，DHQ各劑量組大鼠DI、APTT、TT，DHQ高劑量組大鼠PT均顯著升高或延長，差異均有統計學意義。這提示DHQ可一定程度地改善局灶性腦缺血損傷模型大鼠的全血黏度、血漿黏度、紅細胞參數以及APTT、PT、TT異常，使得大鼠血液黏稠度降低，血液流動性和體內微循環得以改善。此外，與模型組比較，尼莫地平組和DHQ各劑量組大鼠全血還原黏度、FIB水平均無明顯變化，提示這兩者可能并非該藥作用的靶點。

綜上所述，DHQ對局灶性腦缺血損傷模型大鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與改善其血液流變學相關指標以及凝血功能異常有關。本研究雖初步考察了DHQ對局灶性腦缺血損傷模型大鼠腦組織、血液流變學、紅細胞參數、凝血功能的影響，但腦缺血損傷的病理機制十分復雜，其具體作用機制還有待從細胞及分子生物學水平進行深入探討。

參考文獻

[ 1 ] 周皖舒，彭年春，時立新，等.貴陽地區60歲以上老年人群心腦血管疾病危險因素研究[J].貴州醫科大學學報，2016，41（8）：935-938.

[ 2 ] 曾聰彥，胡瑩，高玉橋，等.熄風通腦膠囊對局灶性腦缺血再灌注大鼠血液流變學的影響[J].中成藥，2015，37（9）：2037-2040.

[ 3 ] SHIKOV AN，POZHARITSKAYA ON，MIROSHNYK I，et al. Nanodispersions of taxifolin：impact of solid-state properties on dissolution behavior[J]. Int J Pharm，2009，377（1/2）：148-152.

[ 4 ] ZU S，YANG L，HUANG J，et al. Micronization of taxifolin by supercritical antisolvent process and evaluation of radical scavenging activity[J]. Int J Mol Sci，2012，13（7）：8869-8881.

[ 5 ] 林溢煌，方蓮花，杜冠華.心肌缺血/再灌注中RhoA的調控作用研究進展[J].中國藥理學通報，2015，31（10）：1336-1339.

[ 6 ] 蔡華君.二氫槲皮素的抗炎抗過敏及止癢活性研究[D]. 長春：吉林農業大學，2015.

[ 7 ] VLADUTIA GD，MIDDLETON E JR. Effect of flavonoids on enzyme secretion and endocytosis in normal and mucolipidosisⅡ fibroblasts[J]. Life Sci，1986，39（8）：717-726.

[ 8 ] 王知斌，翟亞東，蘇曉琳，等.二氫槲皮素對H2O2誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用[J].中醫藥信息，2014，31（4）：16-19.

[ 9 ] IVANOV IS，SIDEHMENOVA AV，SMOL’YAKOVA VI，et al. Inhibition of adenosine diphosphate-induced platelet aggregation by alpha-lipoic acid and dihydroquercetin in vitro[J]. Indian J Pharmacol，2014，46（4）：430-432.

[10] 韓經丹.通絡化痰膠囊及其有效成分對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用及機制研究[D].北京：北京中醫藥大學，2012.

[11] MAKSIMOVICH NY，DREMZA IK，TROIAN EI，et al. The correcting effects of dihydroquercetin in cerebral ischemia reperfusion injury[J]. Biomed Kinm，2014，60（6）：643-650.

[12] 李春紅，趙世珂，賈敏.舒愈膏外敷對腦缺血模型大鼠肢體功能、血流變學及腦血流量的影響[J].中華中醫藥學刊，2012，30（9）：2089-2090.

[13] 李勇，夏翠英，呂明安.胃萎湯對氣虛血瘀證大鼠血液流變學指標的影響[J].安徽中醫學院學報，2005，24（1）：22-24.

[14] 李志強.欣通膠囊對急性心肌缺血大鼠血液流變學的影響[D].哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2011.

[15] 趙菲菲，藺良才，楊馨，等.白及非多糖組分對大鼠血小板活化及血液流變學的影響[J].中成藥，2017，39（2）：244-249.

[16] BANERJEE A，ZHANG X，MANDA KR，et al. HIV proteins（gp120 and Tat）and methamphetamine in oxidative stress-induced damage in the brain：the potential role of the thiol antioxidant n-acetylcysteine amide[J]. Free Radic Biol Med，2010，48（10）：1388-1398.

[17] 陳小月.對急性進展性腦梗死患者進行凝血4項檢測的臨床價值[J].當代醫藥論叢，2017，15（19）：190-191.

[18] 袁廷偉，孫芳玲，王曉峰，等.莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠凝血4項的影響[J].中國康復理論與實踐，2013，19（2）：104-106.

[19] 周敏，彭丹亞.龍生蛭膠囊聯合尼莫地平治療急性腦梗死的臨床研究[J].現代藥物與臨床，2018，33（11）：2836- 2839.

（收稿日期：2018-07-11 修回日期：2019-01-02）

（編輯：張元媛）