加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)2型糖尿病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用

吳華英　夏帥帥　黃惠勇　潘繼興　李靜　賀佐梅　邵峰　曾光

〔摘要〕 目的 探討加味生脈補(bǔ)心丹（以下簡(jiǎn)稱BXD）對(duì)自發(fā)性非肥胖2型糖尿病Goto-kakisaki （GK） 大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。方法 8～9周齡雄性Wistar大鼠8只作為空白組，另將40只糖尿病模型GK大鼠按隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為5組，分別為：模型組、西藥組（格列齊特緩釋片組）、BXD低劑量組、BXD中劑量組、BXD高劑量組。各組大鼠按治療方法給藥10周后處死，腹主動(dòng)脈采血檢測(cè)空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbAlc）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），取左心室行心肌組織HE染色、PAS染色觀察病理改變，免疫組化測(cè)定心肌凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組FPG、HbAlc顯著升高（P<0.01），SOD、GSH-Px均顯著降低（P<0.01），MDA顯著升高（P<0.01）;HE染色可見心肌組織水腫壞死、纖維溶解斷裂;PAS染色可見大量糖原物質(zhì)沉積;免疫組化示心肌組織Bax表達(dá)增多、Bcl-2表達(dá)減少（P<0.01）。與模型組比較，BXD低劑量組FPG降低（P<0.05），西藥組和BXD中、高劑量組FPG均顯著降低（P<0.01）;西藥組HbAlc顯著降低（P<0.01），BXD高劑量組HbAlc降低（P<0.05）;西藥組與BXD高劑量組SOD、GSH-Px均顯著升高（P<0.01）、MDA含量均降低（P<0.05）;西藥組、BXD高劑量組Bax表達(dá)顯著減少（P<0.01），西藥組及BXD中劑量組、高劑量組Bcl-2表達(dá)顯著增多（P<0.01）。結(jié)論 BXD對(duì)GK大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)抗氧化能力、抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而起到心肌保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病心肌病;加味生脈補(bǔ)心丹;GK大鼠;氧化應(yīng)激;細(xì)胞凋亡

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.005

Protective Effects of Jiawei Shengmai Buxin Dan （BXD） on Myocardial Injury in

Type 2 Diabetic Rats

WU Huaying1， XIA Shuaishuai1， HUANG Huiyong1*， PAN Jixing2， LI Jing1， HE Zuomei1， SHAO Feng1， ZENG Guang3

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostic in Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Changsha Traditional Chinese Medicine Hospital， Changsha， Hunan 410005， China; 3. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the protective effects of Jiawei Shengmai Buxin Dan （BXD） on myocardial injury in spontaneous non-obese type 2 diabetes Goto-kakisaki （GK） rats. Methods Eight male Wistar rats aged 8-9 weeks were used as a blank group. 40 diabetic GK rats were randomly divided into 5 groups： the model group， the Western medicine group （Gliclazide Sustained-release Tablets）， BXD low dose group， BXD medium dose group， BXD high dose group. The rats in each group were sacrificed 10 weeks after treatment， and abdominal aortic blood sampling was used to detect fasting blood glucose （FPG）， glycosylated hemoglobin （HbAlc）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， and malondialdehyde （MDA）. The left ventricle was taken for myocardial tissue HE staining. PAS staining was performed to observe pathological changes. The immunohistochemistry was used determine the expression of Bax and Bcl-2 protein related to myocardial apoptosis. Results Compared with the blank group， FPG and HbAlc were significantly increased in the model group （P<0.01）; SOD and GSH-Px were significantly decreased （P<0.01）， and MDA was significantly increased （P<0.01）; HE staining showed edema necrosis and fibrinolysis rupture in myocardial tissue; PAS staining showed a large amount of glycogen deposition; immunohistochemistry showed increased expression of Bax and decreased expression of Bcl-2 in myocardial tissue （P<0.01）. Compared with the model group， the FPG of the BXD low-dose group was decreased （P<0.05）， and the FPG of the western medicine group， the BXD medium and high dose group were significantly decreased （P<0.01）; HbAlc in the western medicine group was significantly decreased （P<0.01）， and decreased in the BXD high dose group （P<0.05）. The SOD and GSH-Px in the western medicine group and the BXD high dose group were significantly increased （P<0.01） and the MDA content was decreased （P<0.05）. The expression of Bax in the western medicine group and BXD high dose group was significantly decreased （P<0.01）， and the expression of Bcl-2 in the western medicine group， BXD middle dose group and high dose group increased significantly （P<0.01）. Conclusion BXD has protective effects on myocardial injury in GK rats. The mechanism may enhance myocardial cell apoptosis by enhancing antioxidant capacity and inhibiting cardiomyocyte apoptosis.

〔Keywords〕 diabetic cardiomyopathy; Jiawei Shengmai Buxin Dan; GK rats; oxidative stress; apoptosis

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy， DCM）是排除了因高血壓病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心臟瓣膜病及其他心臟病導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)與功能異常的心肌病，最終可發(fā)展為心力衰竭而死亡[1]，屬于糖尿病微血管并發(fā)癥之一，具有癥狀隱匿、致病長(zhǎng)久等特點(diǎn)。糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到多種調(diào)控途徑，目前尚未闡釋清楚，氧化應(yīng)激被廣泛認(rèn)為是該疾病發(fā)病機(jī)制的主要原因之一[2]，糖尿病狀態(tài)下機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)，大量活性氧（reactive oxygen species， ROS）產(chǎn)生，使促凋亡基因釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，從而引起心肌細(xì)胞損傷[2-3]。“加味生脈補(bǔ)心丹”（以下簡(jiǎn)稱BXD）是已在臨床使用多年的經(jīng)驗(yàn)方[4]，在我們前期的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)該方能顯著改善2型糖尿病心肌損傷大鼠糖脂代謝紊亂，明顯減輕心肌纖維化、心肌肥大程度[5-6]。Goto-Kakisaki（GK）大鼠屬自發(fā)性非肥胖型2型糖尿病大鼠，是選擇糖耐量處于上限的Wistar大鼠經(jīng)過近親繁殖數(shù)代產(chǎn)生[7]。文獻(xiàn)報(bào)道GK大鼠在8周齡時(shí)即可出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大等病理改變[8]，且隨周齡增大其心臟功能及結(jié)構(gòu)也會(huì)不同程度受損[9-12]，在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)12周齡的GK大鼠可出現(xiàn)空腹血糖升高并伴有心肌組織輕度損傷等病理改變，故本研究采用更加符合人類致病特征的GK大鼠，聯(lián)合高糖高脂飲食構(gòu)建糖尿病心肌病模型，觀察BXD對(duì)GK大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及心肌凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的影響，探討該方對(duì)GK大鼠心肌損傷的防治作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～9周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠8只，8～9周齡SPF級(jí)雄性GK大鼠42只，體質(zhì)量（200±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;合格證編號(hào)：311615200002581）。Wistar大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，GK大鼠予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，高糖高脂飼料配方如下：基礎(chǔ)飼料60.7%、蔗糖15%、膽固醇4%、膽鹽0.3%、豬油10%、蛋黃粉10%。飼料來源：湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2? 實(shí)驗(yàn)藥品

加味生脈補(bǔ)心丹：人參10 g，黃芪20 g，炒柏子仁10 g，茯苓8 g，生地黃15 g，天花粉12 g，荷葉15 g，丹參15 g，水蛭6 g，檀香2 g，枳實(shí)10 g，炙甘草6 g，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，加水煎煮，濃縮至含生藥4 g/mL。格列齊特緩釋片[施維雅（天津）制藥有限公司]，規(guī)格：30 mg/片×30片，溶于生理鹽水，按2.7 mg/kg予大鼠灌胃。

1.3? 主要試劑與儀器

超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成，A001-1-1-48T;A003-1-48T;A005-48T）;Bax、Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體（Proteintech公司，50599-2-Ig;12789-1-ap）;全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)：深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PW-812;多功能酶標(biāo)分析儀：深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：MB-530。

1.4? 分組及給藥

Wistar大鼠作為空白組，予普通飼料喂養(yǎng);42只GK大鼠予高糖高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周后，經(jīng)尾靜脈采血測(cè)空腹血糖（fasting plasma glucose， FPG）和隨機(jī)血糖，以兩次FPG≥7.0 mmol/L或隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L認(rèn)為2型糖尿病模型成立，隨后將成模的40只GK大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為5組，分別為：模型組，西藥組（格列齊特緩釋片），BXD低、中、高劑量組。各組大鼠予相應(yīng)藥物進(jìn)行灌胃，模型組及空白組給予等體積蒸餾水灌胃。BXD低、中、高劑量組分別按6、12、24 g/kg體質(zhì)量給藥，西藥組按2.7 mg/kg體質(zhì)量灌胃，灌胃體積為10 mL/kg。各組大鼠每天灌胃1次，連續(xù)給藥10周后處死。實(shí)驗(yàn)過程中BXD低、中劑量組各死亡1只，其中1只死于氣道損傷，另1只死因不明。

1.5? 指標(biāo)檢測(cè)

記錄大鼠體質(zhì)量，尾靜脈采血測(cè)FPG;末次給藥后，大鼠隔夜禁食12 h，取材前對(duì)各組大鼠稱體質(zhì)量，按3 mL/kg體質(zhì)量向各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，固定大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min，4 ℃，離心10 min，取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)糖化血紅蛋白（HbAlc），嚴(yán)格按試劑盒說明檢測(cè)血清SOD、MDA、GSH-Px。取左心室心肌組織，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成切片，行HE染色、PAS染色等病理形態(tài)學(xué)觀察;免疫組化檢測(cè)Bax、Bcl-2表達(dá)。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料以“x±s”表示，采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間兩兩比較采用單因素方差分析法，方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，P<0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01認(rèn)為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)GK大鼠一般情況的影響

空白組大鼠毛發(fā)色白干凈、有光澤，精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，墊料干凈無(wú)異味，體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯，舌色、唇色淡紅潤(rùn)澤;模型組毛發(fā)明顯發(fā)黃枯燥、雜亂易脫落，精神萎靡，活動(dòng)量明顯減少，反應(yīng)遲鈍、嗜睡，喜溜邊、扎堆，墊料潮濕、有爛氣味，大便軟，舌色、唇色暗紫。從外在證候觀察，BXD低劑量組一般情況無(wú)明顯改善。西藥組及BXD中、高劑量組毛發(fā)無(wú)明顯發(fā)黃，精神狀態(tài)、活動(dòng)度較好，唇色及舌色紅潤(rùn)。

2.2? 加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)GK大鼠FPG、HbAlc的影響

FPG：藥物干預(yù)10周后，與空白組比較，模型組FPG顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，BXD低劑量組FPG降低（P<0.05）;西藥組、BXD中、高劑量組FPG顯著降低（P<0.01）。

HbAlc：與空白組比較，模型組HbAlc顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，西藥組HbAlc顯著降低（P<0.01），BXD高劑量組HbAlc降低（P<0.05），BXD低、中劑量組HbAlc差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3? 加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)GK大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組SOD、GSH-Px均顯著降低（P<0.01），MDA顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，西藥組SOD、GSH-Px均顯著升高（P<0.01），MDA降低（P<0.05）;BXD高劑量組SOD、GSH-Px顯著升高（P<0.01），MDA降低（P<0.05）;BXD中、低劑量組GSH-Px顯著升高（P<0.01或P<0.05）;BXD中、低劑量組MDA、SOD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4? 加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)GK大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)的影響

HE染色：光鏡下可見空白組心肌細(xì)胞核呈圓形或者橢圓形，細(xì)胞核位于中央細(xì)胞內(nèi)肌原纖維排列整齊，心肌纖維完整無(wú)斷裂、重排，心肌細(xì)胞未見固縮性壞死。模型組明顯可見心肌細(xì)胞核邊緣模糊，有毛刺，胞核位置偏向兩端，心肌纖維排列紊亂，可見斷裂不完整纖維;心肌細(xì)胞肥大、水腫明顯（淡染），可見固縮變性、局灶性壞死的心肌細(xì)胞;西藥組心肌纖維排列較整齊，偶可見溶解斷裂，心肌細(xì)胞水腫及壞死明顯減少;BXD低劑量組心肌纖維可見明顯的溶解斷裂，心肌細(xì)胞水腫壞死、排列紊亂;BXD中、高劑量組可見心肌細(xì)胞肌原纖維排列整齊，邊緣光滑，無(wú)明顯斷裂，未見明顯水腫及壞死細(xì)胞。見圖1。

PAS染色可見：空白組心肌組織淡染，紫紅色糖原陽(yáng)性染色區(qū)域極少;模型組心肌組織中明顯可見大量深染的糖原陽(yáng)性物質(zhì)沉積;BXD低劑量組心肌組織中糖原陽(yáng)性物質(zhì)沉積明顯;西藥組及BXD中、高劑量組心肌組織淡染，糖原陽(yáng)性物質(zhì)明顯減少。見圖2。

2.5? 加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Bax蛋白表達(dá)：空白組心肌組織中空白組心肌組織中Bax蛋白染色較淡、表達(dá)較弱，厚度小;與空白組比較，模型組Bax表達(dá)顯著增多（P<0.05）;與模型組比較，西藥組、BXD高劑量Bax表達(dá)顯著減少（P<0.01）;BXD中劑量組Bax表達(dá)減少（P<0.05）。見圖3、表3。

Bcl-2蛋白表達(dá)：空白組心肌組織中Bcl-2蛋白染色呈深棕色，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，厚度適中;與空白組比較，模型組心肌組織Bcl-2表達(dá)顯著減少（P<0.01）;與模型組比較，西藥組及BXD中、高劑量組Bcl-2表達(dá)顯著增多（P<0.01）;BXD低劑量組Bcl-2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4、表3。

3 討論

糖尿病在中醫(yī)中屬“消渴病”范疇，糖尿病心肌病作為糖尿病心血管并發(fā)癥之一，目前多根據(jù)臨床所表現(xiàn)的不同癥狀，如糖尿病患者并發(fā)心悸、心慌、胸痛、心痛等，而將其歸類為“消渴病”并發(fā)“心悸”“怔忡”“胸痹”“心痛”，屬于“消渴病心病”范疇。林蘭教授[13]指出糖尿病心肌病病機(jī)是以心氣虛、心陰虛為主，兼夾血瘀的本虛標(biāo)實(shí)證，故在治療上主要以益氣養(yǎng)陰為主，再佐以活血化瘀、化痰通絡(luò)等治法。加味生脈補(bǔ)心丹是課題組在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上自擬而成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、化痰通絡(luò)之功。該方由人參、黃芪、生地黃、天花粉、丹參、水蛭、檀香、柏子仁、枳實(shí)、茯苓、荷葉、炙甘草等組成，全方補(bǔ)氣陰之虛以治本為主，瀉痰瘀之實(shí)以治標(biāo)為輔，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療效果顯著，在我們前期的實(shí)驗(yàn)研究中也得到了驗(yàn)證[5-6]。

本研究中我們采用自發(fā)性非肥胖2型糖尿病GK大鼠聯(lián)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)建立糖尿病心肌病模型。GK大鼠是選取口服糖耐量處于上限的Wistar大鼠，經(jīng)過反復(fù)近交繁殖數(shù)代而來，該鼠種主要表現(xiàn)為空腹血糖增高，進(jìn)食后高血糖、胰島素分泌受損與葡萄糖不耐受等，是研究2型糖尿病較為理想的國(guó)際公認(rèn)的動(dòng)物模型之一，長(zhǎng)期患病后容易并發(fā)心血管病癥[14-15]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)GK大鼠在實(shí)驗(yàn)后期體質(zhì)量增幅緩慢，這與該鼠種屬非肥胖型的特性有關(guān);模型組大鼠FPG顯著高于空白組，且心肌組織HE染色可見心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維排列紊亂、斷裂及局灶性壞死;PAS染色可見心肌組織內(nèi)大量糖原陽(yáng)性物質(zhì)沉積等病理性改變，成功構(gòu)建了糖尿病心肌病模型，成模率可達(dá)95.2%。

本研究中采用的陽(yáng)性對(duì)照藥格列齊特緩釋片是第二代磺脲類口服降糖藥，是臨床上治療非肥胖、空腹胰島素水平正常或偏低2型糖尿病首選藥物之一;其結(jié)構(gòu)中含有氮雜環(huán)，該雜環(huán)具有清除自由基的作用，因而具有改善氧化應(yīng)激的獨(dú)特作用[16-17]，同時(shí)還具有減少動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)生的作用[16，18]。氧化應(yīng)激是胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病發(fā)病的共同土壤[19]，SOD、GSH-Px等是機(jī)體抗氧化損傷的重要屏障;SOD是體內(nèi)唯一可清除超氧陰離子的天然抗氧化酶，在對(duì)抗氧化損傷方面具有重要作用。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它能夠催化還原型谷胱甘肽（reducedglutathione， GSH）變?yōu)檠趸凸入赘孰模╫xidizidedglutathione， GSSG），使細(xì)胞不受過氧化物的干擾及損害。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)模型組SOD、GSH-Px水平顯著降低，MDA水平顯著升高，而BXD能顯著提高SOD、GSH-Px水平，減少M(fèi)DA含量，表明該方具有良好的抗氧化作用。Bcl-2是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)與凋亡有關(guān)的基因，Bcl-2基因家族主要包括Bcl-2等抑制凋亡蛋白及Bax等促凋亡蛋白;大量研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激介導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡，高血糖狀態(tài)下大量ROS生成，可激活多條信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、損傷內(nèi)皮細(xì)胞、導(dǎo)致心肌肥厚等[20];此外，ROS還可以引起線粒體的損傷，釋放促凋亡基因，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化下游的Caspase家族，啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序，從而引起心肌細(xì)胞損傷[21]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)模型組Bcl-2表達(dá)顯著減少，Bax表達(dá)顯著增加，而BXD能顯著增加Bcl-2的表達(dá)，減少Bax表達(dá)，說明該方具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，其可能機(jī)制是通過增強(qiáng)抗氧化能力從而減少心肌細(xì)胞損傷。

中醫(yī)藥在防治糖尿病并發(fā)癥的整體調(diào)節(jié)上具有很大優(yōu)勢(shì)，BXD一方通過諸藥配伍起到標(biāo)本兼治的作用，能夠從多靶點(diǎn)、多方位對(duì)疾病起到整體治療的效果，這也是中藥復(fù)方的特色與優(yōu)勢(shì)所在，然而其作用的內(nèi)在分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，還有許多值得深入探討的地方。通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除能力，抑制氧化應(yīng)激對(duì)心肌的損傷，從而發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用，是延緩糖尿病心肌病發(fā)展的治療策略之一。

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