羥基紅花黃色素A對氧化應激損傷血管內皮 細胞的保護作用研究

崔麗霞　孫麗萍　趙丕文　劉欣　石丹寧　陳夢

〔摘要〕 目的 探討羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A， HSYA）對血管內皮細胞氧化應激損傷的保護作用及其可能機制。方法 體外培養人血管內皮細胞EC-304，用H2O2構建細胞氧化應激損傷模型，分別設置正常對照組、H2O2損傷模型組、HSYA藥物組，其中各藥物組用不同濃度的HSYA預培養細胞24 h后加入50 μmol/L的H2O2，繼續培養12 h。用MTT法檢測細胞的增殖活力，用試劑盒檢測各組細胞內超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的含量，用Western Blot法檢測各組細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表達水平。結果 與H2O2模型組相比，HSYA能顯著提高細胞存活率，且呈劑量依賴性，提高細胞內SOD的活性，提高細胞內NO的含量，降低Bax表達，提高 Bcl-2表達，降低Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達（P<0.01或P<0.05）。

結論 HSYA對于H2O2誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷具有保護作用，其可能的作用機制與抑制EC-304細胞凋亡相關。

〔關鍵詞〕 羥基紅花黃色素A;血管內皮細胞;氧化應激損傷;細胞凋亡

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.009

Protective Mechanism of Hydroxysafflor Yellow A on Vascular Endothelial Cells Injured by Oxidative Stress

CUI Lixia1， SUN Liping1， ZHAO Piwen1， LIU Xin2， SHI Danning1， CHEN Meng1*

（1. Beijing University of Chinese Medcine， Beijing 102488， China; 2. The Third Affiliated Hospital of

Beijing Univesity of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

〔Abstract〕 Objective To study the protective mechanism of hydroxysafflor yellow A （HSYA） on vascular endothelial cells injured by oxidative stress. Methods EC-304 human vascular endothelial cells were cultured in vitro. An oxidative stress injury model was established with H2O2. The cells were divided into several groups， namely control group， H2O2 injury model group， and HSYA groups. The cells in HSYA groups were pre-cultured with different concentrations of HSYA for 24 h， followed by addition of 50 μmol/L H2O2， and the cells were then cultured for another 12 h. Cell proliferation activity was determined by MTT assay， the content of superoxide dismutase （SOD） and nitric oxide （NO） was measured by kits， and the protein expression levels of Bax， Bcl-2， Caspase-3， and cleaved Caspase-3 were determined by Western Blot. Results Compared with the H2O2 model group， HSYA significantly increased the cell survival rate in a dose-dependent manner， and it significantly increased SOD activity， NO content， and Bcl-2 expression and significantly reduced the expression of Bax， Caspase-3， and cleaved Caspase-3 （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion HSYA has a protective effect on H2O2-induced oxidative stress injury of vascular endothelial cells， and the mechanism is possibly related to inhibition of the apoptosis of EC-304 cells.

〔Keywords〕 hydroxysafflor yellow A; vascular endothelial cell; oxidative stress injury; apoptosis

血管內皮細胞是襯于血管內壁的單層扁平上皮細胞，在人體內具有吞噬異物、分泌生長因子、參與血管形成、調節血管張力、凝血、纖溶等多種生理功能，保證心血管系統的正常運轉。血管內皮細胞損傷是造成高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的因素，而氧化應激和細胞凋亡又是導致內皮細胞損傷的主要原因[1]，因此，抑制血管內皮細胞免受氧化應激損傷，抑制細胞凋亡，保護細胞功能，對于治療心血管疾病具有重要臨床意義。

紅花是活血通經、祛瘀止痛的中藥，羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A， HSYA） 是紅花的主要活性成分，具有查爾酮類結構，有抗炎、抗腫瘤、治療婦科疾病等多種藥理作用，本課題組前期對于HSYA的雌激素樣作用也進行了相關研究[2]。本實驗選取人血管內皮細胞EC-304為研究對象，在體外用H2O2處理制備氧化應激損傷模型，誘導細胞凋亡，探討HSYA對氧化應激損傷細胞的保護作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 細胞株? 人臍靜脈血管內皮細胞株（EC-304）購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.1.2? 藥物? HSYA購自中國藥品生物制品檢定所，質量分數≥98%，實驗時用二甲基亞砜（DMSO）溶解至所需濃度，4 ℃保存備用。

1.1.3? 主要試劑? 1640培養基（Gibco公司）;胎牛血清FBS（Hyclone公司）;0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）;PBS緩沖液（Solarbio公司）;H2O2（Amresco公司）;DMSO（Sigma公司）;四甲基偶氮唑藍MTT（江蘇凱基生物技術股份有限公司）;SOD試劑盒、NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司）;一抗：Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3（Abcam公司）;二抗：Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（北京普利萊基因技術有限公司）;蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;ECL化學發光試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）;顯影液、定影液（天津市世紀奧博公司）。

1.1.4? 主要儀器? VS-1300L-U超凈臺（日本AIRTECH公司）;MC0-18AIC細胞培養箱（日本SANYO公司）;TS100普通倒置顯微鏡（日本NIKON公司）;SAFIREⅡBASIC多功能熒光酶標儀（瑞士TECAN公司）;3K15低溫高速離心機（美國SIGMA公司）;WD-9405B水平搖床（北京六一儀器廠）;DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠）;Mini-PROTEAN Tetra Cell單垂直電泳槽、Mini-PROTEAN Ⅱ轉移電泳槽（BIO-RAD公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 細胞培養? 用含10%胎牛血清的1640培養基，在37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱中，靜置培養EC-304細胞。傳代3次以上，待細胞狀態穩定后，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2? H2O2損傷模型的構建? 取對數生長期EC-304細胞，用0.25%胰酶消化5 min，制成細胞混懸液，以5×103個/孔接種于96孔培養板。待細胞貼壁后，吸去培養液，以含H2O2終濃度分別為50、100、200、400、800 μmol/L的培養基對細胞進行培養，12 h后測定490 nm處吸光度值，選取合適的H2O2造模濃度，構建細胞氧化應激損傷模型。

1.2.3? MTT法檢測細胞增殖活力 取對數生長期EC-304細胞，以5×103個/孔接種于96孔培養板。待細胞貼壁后，吸去培養液，實驗組加入終濃度分別為1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L的HSYA，同時設置正常對照組（無任何處理）和H2O2模型組（50 μmol/L H2O2），每組設4個復孔，置于CO2培養箱中，連續培養12、24、36 h后，吸棄對照組的培養液，再加入100 μL的完全培養基繼續作用12 h。吸棄模型組和各藥物組的培養液，加入100 μL含H2O2終濃度均為50 μmol/L的培養基繼續作用12 h。終止培養，用PBS緩沖液清洗。向各孔加入MTT 100 μL，于培養箱中避光孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，在搖床上震蕩10 min，使紫色結晶完全溶解。用酶標儀測定各組在490 nm處的吸光度值，計算細胞的增殖率。

細胞增殖率=（受試物的平均OD值/對照組的平均OD值）×100%

1.2.4? Wst-1法測定細胞SOD含量? 取對數生長期EC-304細胞，終止培養，棄培養基，用預冷的PBS緩沖液沖洗，加胰酶進行消化，收集細胞混懸液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，將離心管置于冰上。加入預冷的裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），不斷混勻，待細胞完全裂解后，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，吸取上清液。按照說明書，在96孔板中操作，設置對照組、對照空白組、測定組和測定空白組，其中測定孔與測定空白孔又包括正常對照組、模型組和不同濃度HSYA組。置于水平搖床37 ℃孵育20 min，酶標儀測定波長為450 nm處的吸光度值。

1.2.5? 一步法測定細胞NO含量? 取對數生長期EC-304細胞，收集細胞混懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，留細胞沉淀，用PBS緩沖液清洗2次，加入200 μL PBS緩沖液，冰水浴條件下超聲破碎，制備好勻漿液。在96孔板中操作，設置空白孔、標準孔、測定孔，空白孔加入雙蒸水，標準孔加入亞硝酸鈉標準液，測定孔中加入各組經處理的細胞上清液（勻漿液300 μL加試劑一200 μL，渦旋充分混勻后靜置10 min，4 000 r/min離心15 min，吸上清），分別加入顯色劑反應，靜置15 min，酶標儀測定550 nm波長處的各孔吸光度值。

NO含量（μmol/L）=■×

標準品濃度（20 μmol/L）×稀釋倍數

1.2.6? Western Blot檢測細胞蛋白表達? 取對數生長期細胞，終止培養，棄培養基，用預冷的PBS沖洗，加胰酶進行消化，收集細胞混懸液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，將離心管置于冰上。加入預冷的蛋白裂解液，不斷混勻，待細胞完全裂解后，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，吸取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測蛋白含量。用上樣緩沖液調節蛋白樣品，加熱變性后，迅速入冰冷卻。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，80 V恒壓電泳1 h，待條帶跑至濃縮膠與分離膠的交界處時，電壓換為120 V。120 V恒壓濕法轉膜75 min，室溫下封閉1 h。加入一抗（β-actin 1∶15 000，Bax 1∶1 000，Bcl-2 1∶2 000，Caspase-3 1∶5 000，cleaved Caspase-3 1∶3 000）后于4 ℃冰箱中過夜，次日洗去一抗，孵育二抗（二抗1∶5 000），滴加ECL發光液后顯影定影。用Image J軟件分析結果。

1.2.7? 統計學分析? 實驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，先對數據進行正態分析及方差齊性檢驗，符合正態分布和方差齊，采用單因素方差分析ANOVA檢驗，組間比較用LSD（L）;不符合正態分布和方差齊的，用非參數檢驗。數據均用“x±s”表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? H2O2對細胞活力的影響

如表1所示，與正常對照組相比，50 μmol/L的 H2O2可顯著抑制細胞增殖（P<0.01）。由于100 μmol/L至更高劑量的H2O2對細胞抑制率過大，易產生細胞毒性（如圖1所示），因此，選擇50 μmol/L 的H2O2作用12 h作為EC-304細胞的氧化應激損傷造模條件。

2.2? HSYA對細胞增殖活力的影響

如表2所示，在24 h時，與對照組相比，模型組中細胞增殖率顯著下降（P<0.01）;與模型組相比，各藥物組細胞增殖率均顯著提高（P<0.01），且HSYA濃度越高，效果越顯著，呈劑量依賴性。在12 h和36 h時，與模型組相比，高濃度的HSYA（1×10-5 mol/L）促進細胞增殖作用最顯著（P<0.01），HSYA（1×10-6、1×10-7 mol/L）對細胞也有促進作用（P<0.05）。

2.3? HSYA對細胞SOD含量的影響

如表3所示，與正常對照組相比，模型組SOD含量明顯低于正常組，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組相比，HSYA濃度為1×10-5 mol/L時，SOD含量明顯高于模型組，且差異有統計學意義（P<0.01）。

2.4? HSYA對細胞內NO含量的影響

如表4所示，與正常組相比，模型組中NO的含量明顯低于正常組，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，HSYA濃度為1×10-5 mol/L時，NO的含量明顯高于模型組，且差異有統計學意義（P<0.01）。

2.5? HSYA對細胞蛋白表達水平的影響

如圖2-3所示，加入HSYA預處理后，與模型組相比，Bax的表達量和Bax/Bcl-2的比值顯著降低（P<0.01），Bcl-2的表達量顯著升高（P<0.01），且HSYA劑量越高，效果越明顯，呈劑量依賴性。藥物組與模型組相比，Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達含量顯著降低（P<0.01），且HSYA劑量越高，效果越明顯，呈劑量依賴性。

3 討論

活性氧自由基引起的血管內皮細胞氧化應激損傷是誘發多種心血管疾病的病因。H2O2是機體代謝產生的一種氧自由基，血管內皮細胞受到H2O2的刺激后，打破了原本的氧化與抗氧化平衡狀態，引起細胞功能障礙，誘發細胞凋亡[3-4]。本實驗選取50 umol/L的H2O2作用于EC-304細胞，建立氧化應激損傷模型。預先加入HSYA可以提高細胞的存活率，提高細胞中SOD表達水平及NO的含量，且呈一定的劑量依賴關系。SOD是機體內抗氧化酶系的主要成員，可以有效地清除氧自由基，保護細胞免受氧化損傷，其含量越高表明機體的抗氧化能力越強。NO在體內具有廣泛生理作用，在血管系統中，它主要由內皮細胞釋放，可以阻止內皮細胞凋亡，調節平滑肌以調節血管張力，減少血小板聚集，防止血栓形成。NO的生成量減少被認為是血管內皮功能障礙的原因之一[5]。

細胞凋亡是指細胞由基因調控的一種自主有序的死亡，是維持機體內環境穩定的方式。其中與細胞凋亡關系最為密切的基因包括Bcl-2、Caspase兩大家族。Bcl-2蛋白家族是由B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）編碼而成，包括Bcl-2樣促生存亞家族和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）樣促凋亡亞家族，正常細胞中這兩者處于平衡狀態。在細胞凋亡過程中，Bax通過與Bcl-2形成異源二聚體，封閉 Bcl-2活性，誘導細胞凋亡[6]。因此Bax與Bcl-2比值是決定細胞凋亡與否的關鍵因素。Caspase是一類含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，Caspase蛋白酶家族有11個成員，與細胞凋亡密切相關[7]，Caspase依賴的凋亡通路主要包括死亡受體介導的凋亡通路和線粒體介導的凋亡通路[8-9]。死亡受體與配體結合激活Caspase-8，線粒體釋放細胞色素C激活Caspase-9，兩條通路最終都刺激Caspase級聯，激活Caspase-3。活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（clevead Caspase-3）與Bcl-2結合，抑制其活性，誘導細胞凋亡[10]，因此，Caspase-3在凋亡程序中起到執行者的關鍵作用[11]。實驗結果顯示加入HSYA的藥物組Bax和Bax/Bcl-2的比值顯著降低，Bcl-2的比值顯著升高，Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達含量顯著降低，提示HSYA可以抑制細胞凋亡，減輕氧化應激損傷。

HSYA作為中藥紅花的主要活性成分，近年來對其抗氧化作用的研究較多[12-13]，但是對其在心血管系統的抗氧化研究并不多。本實驗對HSYA保護H2O2造成的血管內皮細胞氧化應激損傷的作用進行研究，結果表明，HSYA可以提高損傷細胞的增殖率，增加細胞內抗氧化酶的活性，抑制細胞凋亡，并且具有劑量依賴性。這一結果為我們深入研究HSYA保護心血管疾病的作用機制和途徑提供了實驗基礎，為其臨床應用提供了理論依據，奠定了新思路。

參考文獻

[1] CHEN X， PANG S， LIN J， et al. Allicin prevents oxidized low-density lipoprotein-induced endothelial cell injury by inhibiting apoptosis and oxidative stress pathway[J]. BMC Complementary &Alternative Medicine， 2016，16（1）：1-6.

[2] 陳? 夢，趙丕文，孫麗萍，等.羥基紅花色素A對雌激素效應相關蛋白表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1218-1221.

[3] SUI X， DOU L， CHEN X， et al. miR-291b-3p mediated ROS-induced endothelial cell dysfunction by targeting HUR[J]. International Journal of Molecular Medicine， 2018， 42（5）：2383-2392.

[4] NIKE E. Oxidant-specific biomarkers of oxidative stress. Association with atherosclerosis and implication for antioxidant effects[J]. Free Radical Biology And Midicine， 2018，120：425-440.

[5] STEINHORN B S， LOSCALZO J， MICHEL T. Nitroglycerin and Nitric Oxide-A Rondo of Themes in Cardiovascular Therapeutics[J]. New England Journal of Medicine， 2015， 373（18）：277-280.

[6] YU Y， ZHANG X， LI Z， et al. LncRNA HOTAIR suppresses TNF-αinduced apotosis of nucleus pulposus cells by regulating miR-34a/Bcl-2 axis[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2018，107：729-

737.

[7] OSMAN A M， NEUMANN S， KUHN H G， et al. Caspase inhibition impaired the neural stem/progenitor cell response after cortical ischemia in mice[J]. Oncotarget， 2016， 7（3）：2239-2248.

[8] KURIYAMA S， TSUJI T， SAKUMA T， et al. PLEKHN1 promotes apoptosis by enhancing Bax-Bak hetro-oligomerization through interaction with Bid in human colon cancer[J]. Cell Death Discovery， 2018，4：11.

[9] LOPEZ J， TAIT S W. Mitochondrial apoptosis： killing cancer using the enemy within[J]. British Journal Cancer， 2015，112（6）：957-962.

[10] JUNG S Y， KIM D Y， YUNE T Y， et al. Treadmill exercise reduces spinal cord injury-induced apoptosis by activating the P13K/Akt pathway in rats[J]. Experimental & Therapeutic Medicine， 2014，7（3）：587-593.

[11] DING L， WU J P， XU G， et al. Lentiviral-mediated RNAi targeting caspase-3 inhibits apoptosis induced by serum deprivation in rat endplate chondrocytes in vitro[J]. Brazilian Journal of Medical & Biological Research， 2014，47（6）：445-451.

[12] ZHAO Y， SUN H， LI X， et al. Hydroxysafflor yellow A attenuates high glucose-induced pancreatic β-cells oxidative damage via inhibiting JNK/c-jun signaling pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2018，505（2）：425-440.

[13] PEI J P，? FAN L H，? NAN K， et al. HSYA alleviates secondary neuronal death through attenuating oxidative stress， inflammatory response， and neural apoptosis in SD rat spinal cord compression injury[J]. Journal of Neuroinflammation， 2017，14（1）：97.