油樟葉精油餾分的主要成分、抑菌活性及其主要單體成分抑菌機理研究

胡文杰　戴彩華　周升團

摘 要：采用氣相色譜-質譜聯用儀技術測定油樟葉精油3個餾分（A1、A2和A3）的化學成分，并對其進行了抑尖孢鐮刀菌活性的測定，篩選出最佳抑菌餾分;通過受試菌分別在受到油樟葉精油餾分A3及其主要單體成分（1，8-桉葉油素和α-松油醇，下同）作用后，測定菌絲的生長、孢子的萌發、電導率、還原性糖及可溶性蛋白質等變化特征，進而探討其抑菌的機理。結果表明：從油樟葉精油3個餾分（A1、A2和A3）中，共檢測出的主要化學成分（相對百分含量>1%）有13種，其中A1、A2、A3餾分中各有6、8、12種;3個餾分中含量較高的成分均是1，8-桉葉油素。不同濃度的餾分A3及其主要單體成分對尖孢鐮刀菌均有抑菌作用，其中在150mg/L濃度下的抑菌率分別達到90.46%、84.40%和87.18%。餾分A3及其主要單體成分分別能夠使尖孢鐮刀菌菌絲的生長、孢子的萌發、電導率、還原性糖、可溶性蛋白質以及ATP酶等發生較為明顯的變化，但發生變化的突變點各不相同。它們主要是通過破壞尖孢鐮刀菌的細胞膜結構或功能，導致細胞膜通透性的改變，使菌體內外物質失衡，最終致菌體細胞正常形態和代謝功能喪失，從而達到抑菌的目的。

關鍵詞：油樟;精油餾分;氣相色譜-質譜聯用儀;抑菌機理

中圖分類號 TQ651文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）15-0014-06

Research on Major Constituents，Bacteriostatic Effect and Antibacterial Mechanism of Fractions from Cinnamomum longepaniculatum Leaves Essential Oils and its Major Monomer Components

Hu Wenjie1 et al.

（1 School of Life Sciences，Jinggangshan University，Ji′an 343009，China）

Abstract：The chemical constituents of three fractions （A1，A2 and A3） were determined by gas chromatography-mass spectrometry from Cinnamomum longepaniculatum leaves essential oils. And the best antimicrobial fraction was screened through antimicrobial effects of the determination of fractions.Study on inhibition mechanism of fraction A3 and its major monomer components （1，8-Cineole and α-Terpineol，the same below） through the determination of mycelium growth activity，spore germination rate，electric conductivity，reducing sugar，soluble protein and so on.The results showed that 13 main chemical constituents （relative percentage>1%）were detected from the 3 fractions （A1，A2 and A3） of Cinnamomum longepaniculatum leaves essential oils，There are 6，8 and 12 kinds fractions of A1，A2 and A3，respectively.The content of 1，8-Cineole was all higher of them.Different concentrations of A3 and its major monomers had bacteriostatic effects on Fusarium oxysporum，and the bacteriostatic rates reached 90.46%，84.40% and 87.18% at the concentration of 150mg/L，respectively.Fraction A3 of essential oil and its major monomeric components could significantly change the hyphae growth，spore germination，electrical conductivity，reducing sugar，solube protein and ATPase of Fusarium oxysporum，but the mutation points were different，respectively.They mainly destroy the cell membrane structure or function of Fusarium oxysporum，leading to the change of cell membrane permeability，making the imbalance of substances inside and outside the bacteria，and finally causing the loss of normal morphology and metabolic function of bacterial cells，so as to achieve the purpose of inhibiting bacteria.

Key Words：Cinnamomum longepaniculatum;Essential oil fractions;GC-MS;Antibacterial mechanism

植物精油是從植物花、葉、莖、根、果實等部位中提取的一類具有較強揮發性的植物次生代謝產物，其成分一般由小分子、萜烯類、醇類、醛酮類等物質組成，作用機理復雜，較難使病原菌產生抗性，在農林生物防治等領域具有較好的應用前景[1]。植物精油來源于天然，具有對人體相對安全、與環境友好、生物活性多樣等特點，因此，從天然植物中尋找廣譜、高效、低毒的殺菌劑，已成為科研人員及農藥使用人員的共同目標[2]。

油樟[Cinnamomum longepaniculatum（Gamble）N.Chao]系樟科樟屬常綠喬木，為中國特有的樹種，已被列為國家Ⅱ級重點保護植物[3]。油樟各部位均富含有精油，具有抗菌[4-5]、抗炎[6-7]、鎮痛[8]、抗癌[9]等生理活性。目前，有關油樟精油的提取、成分分析及抑菌效果等已有了較為多的研究報道，但對于油樟葉精油餾分的抑菌效果及其主要單體成分抑菌機理研究尚未見報道。為此，筆者以尖孢鐮刀菌為供試菌，在比較油樟葉精油不同餾分的抑菌效果的基礎上，通過研究最佳抑菌餾分A3及其主要單體成分對尖孢鐮刀菌的形態和生理生化的影響，揭示油樟葉精油餾分A3及其主要單體成分的抑菌機理，為油樟源殺菌劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 供試材料：油樟鮮葉于2018年10月中旬采集于江西吉安。供試菌種：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），由鄭州精思威化工有限公司提供。供試試劑：吐溫-80、丙酮、PBS緩沖液、無水硫酸鈉、ATP酶試劑盒等均為分析純。培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）等。

1.2 主要儀器設備 ShimadzuGCMS-QP2020氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司生產;全自動高壓滅菌，上海博迅實業有限公司生產;H-1650高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司生產;DHP-9052電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司生產;SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司生產等。

1.3 方法

1.3.1 精油各餾分的提取和制備 采用水蒸氣蒸餾法提取油樟鮮葉精油，收集一定量的葉精油，并用無水硫酸鈉干燥后置于分餾瓶中，再經減壓分餾（-0.073MP），收集3種不同溫度的餾分，分別為：60℃以下的餾分，標為A1號精油;60～100℃的餾分，標為A2號精油;100～150℃的餾分，標為A3號精油。

1.3.2 精油各餾分的主要化學成分分析 （1）色譜條件：Rxi-5Sil MS（30m×0.25mm×0.25μm）石英毛細管柱，載氣為高純度氦氣（99.999%），流速為1.0mL/min，氣化室溫度為220℃，柱起始溫度50℃（保持2min），以8℃/min的速率程序升溫到160℃，以8℃/min升溫至250℃（保持15min）至完成分析;分流比為20∶1，進樣量為0.5μL。（2）質譜條件：離子源為EI，電子能量為70eV，離子源溫度為220.0℃，進樣口溫度250℃掃描范圍m/z60～350。

1.3.3 精油各餾分抑菌活性的測定 分別取油樟葉精油的3種餾分（A1、A2和A2）50μL、100μL、150μL、200μL與25mL PDA混合倒平板，制得油樟葉精油的3個餾分濃度為2μL/mL、4μL/mL、6μL/mL、8μL/mL的PDA培養基，并以純PDA倒平板作對照。分別將尖孢鐮刀菌菌絲塊接種到培養皿中央，重復3次，25℃恒溫培養5d后觀察拍照，計算抑菌率。其中，接種在對照平板上的尖孢鐮刀菌菌落平均直徑為Do，接種在含餾分平板上的尖孢鐮刀菌菌落平均直徑為Dx，則抑菌率（%）=（Do-Dx）/Do×100 （1）

1.3.4 精油餾分A3及主要單體成分的抑菌活性與機理

1.3.4.1 供試菌菌絲生長活性的測定 用生長速率測定法[10]分別測定餾分A3及主要單體成分對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用。在無菌操作條件下，向每個培養皿中倒入9mL的PDA培養基，再分別加入1mL精油餾分A3及其主要單體成分，對照組加入1mL丙酮，輕輕搖勻，制成平板，待冷卻凝固后，每個培養皿中接入一個生長一致的菌餅（d=5.0mm）。重復3次，25～26℃培養7d后，再用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率。相關計算公式如下：

菌絲生長抑制率（%）=（對照組菌絲生長直徑-處理組菌絲生長直徑）/（對照組菌絲生長直徑-菌餅直徑）×100 （2）

1.3.4.2 供試菌孢子萌發率的測定[11] 取濃度為1×105cfu/mL的尖孢鐮刀菌的孢子懸浮液100μL，分別加入已經用吐溫-80乳化好的含0μL、25μL、50μL、100μL、150μL餾分A3及其主要單體成分的PDA培養基中，每皿15mL。均勻涂布后立即密封培養皿，以培養基滴入少量吐溫-80未加餾分A3及其主要單體成分的平板作為對照。27℃生化培養箱中培養9h后，在顯微鏡下觀察，并根據公式計算孢子萌發率。相關計算公式如下：

萌發率（%）=[萌發孢子數200]×100 （3）

1.3.4.3 供試菌細胞膜滲透性的測定[12] 采用導電率法測定。挑取尖孢鐮刀菌菌絲接入50mL PDA液體培養基中搖床震蕩（140r/min、25℃）培養2d，過濾菌絲，用0.05mol/L、pH7.2的PBS緩沖液沖洗3次，轉移到20mL的PBS緩沖液中，分別加不同濃度的餾分A3及其主要單體成分，放入搖床繼續振蕩，處理4h取樣，離心（4000r/min，10min）除去菌液體，上清液測定電導率。以不加餾分A3及其主要單體成分的菌液為空白對照組（CK）。

1.3.4.4 供試菌菌液中還原性糖含量的測定[13] 取供試尖孢鐮刀菌在PDA培養基上培養，在第3天菌絲覆蓋整個平板后，用5mm打孔器取菌餅5個接入100mL液體培養基中，設置處理組和對照組，處理組加入60μL同濃度的（150mg/L）餾分A3及其主要單體成分，對照組加入相應滅菌的蒸餾水，將其置于振蕩箱中進行培養，每間隔一定時間測定樣品中還原性糖的含量。

1.3.4.5 供試菌菌液可溶性蛋白質含量的測定[13] 取供試尖孢鐮刀菌在PDA培養基上培養，在第3天菌絲覆蓋整個平板后，用5mm打孔器取菌餅5個接入100mL，液體培養基中，設置處理組和對照組，處理組分別60μL相同濃度的（150mg/L）餾分A3及其主要單體成分，對照組加入相應滅菌的蒸餾水，將其置于振蕩箱中進行培養，每間隔一定時間進行樣品中蛋白質含量測定（25℃，140r/min）。

1.3.4.6 供試菌ATP酶活性的測定 將1mL孢子懸浮液（106CFU/m L）接種于50mL PDA培養基中，分別加入相同濃度的（150mg/L）餾分A3及其主要單體成分，振蕩培養42h（28℃、180r/min），以無菌水為空白對照。每間隔2h取樣1.5mL，離心10min（4℃、12000r/min），棄沉淀取上清液，收集菌絲體，用快速組織細胞破碎儀破碎細胞，取上清棄沉淀，用超微量ATP酶試劑盒測定總ATP酶活性。

2 結果與分析

2.1 精油各餾分的主要化學成分分析 前期已采用GC-MS聯用儀技術對油樟葉精油的3個餾分（A1﹑A2和A3）進行了測定，結果顯示，A1 餾分中主要化學成分（相對百分含量>1%）有6種：2-甲基-5-（1-甲基乙基）-雙環[3.1.0]-2-己烯﹑α-蒎稀﹑4（10）-側柏烯﹑β-蒎烯﹑β-月桂烯和1，8-桉葉油素;A2餾分中主要化學成分（相對百分含量>1%）有8種：2-甲基-5-（1-甲基乙基）-雙環[3.1.0]-2-己烯﹑α-蒎稀﹑4（10）-側柏烯﹑β-蒎烯﹑β-月桂烯﹑（+）-4-蒈烯﹑γ-萜品烯和1，8-桉葉油素;A3餾分中主要化學成分（相對百分含量>1%）有13種：α-蒎稀﹑4（10）-側柏烯﹑β-蒎烯﹑β-月桂烯﹑（+）-4-蒈烯﹑D-檸檬烯﹑γ-萜品烯﹑石竹烯﹑大根香葉烯B﹑1，8-桉葉油素﹑松油烯-4-醇和α-松油醇。3個餾分中含量較高的均是1，8-桉葉油素，其次是4（10）-側柏烯和α-蒎稀。它們的結構式如圖1

（+）-4-Carene][A1，A2，A3][A2，A3][A1，A2，A3]

D-Limonene][γ-萜品烯

γ-Terpinene][石竹烯

Caryophyllene][大根香葉烯 B

8-Cineole][松油烯-4-醇

Terpinen-4-ol ][α-松油醇

α-Terpineol][A1，A2，A3][A3][A3]

2.2 精油各餾分對尖孢鐮刀菌的抑菌活性 油樟葉精油各餾分（A1﹑A2和A3）對尖孢鐮刀菌均具有一定的抑制效果，并分別隨著各餾分濃度的增加，抑制效果更加明顯。當濃度為8μL/mL時，對尖孢鐮刀菌的抑制效果均最為明顯，抑菌率分別達到79.09%、85.51%和89.81%（表1），油樟葉精油餾分A3抑菌率分別為餾分A1和餾分A2的1.14和1.05倍。

2.3 精油餾分A3及其主要單體成分的抑菌活性與機理

2.3.1 對尖孢鐮刀菌菌絲生長活性的抑制 由表2可知，油樟葉精油餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素分別對尖孢鐮刀菌菌絲生長均有一定的抑制作用，其中餾分A3對尖孢鐮刀菌的作用更強一些。在濃度相同的情況下（150mg/L），油樟葉精油餾分A3、1，8-桉葉油素及α-松油醇對尖孢鐮刀菌的抑制作用從大到小依次為餾分A3>α-松油醇>1，8-桉葉油素;而隨著餾分A3、α-松油醇及1，8-桉葉油素濃度的增加，抑制作用均增大。

2.3.2 對尖孢鐮刀菌孢子萌發率的影響 根據1.3.4.2實驗方法，測得油樟葉精油餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素分別在不同體積下尖孢鐮刀菌孢子的萌發個數并計算出萌發率，結果見圖2。由圖2可知，隨著餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素各自體積的不斷增加，其萌發個數在不斷降低，萌發率也在不斷下降，說明餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素對尖孢鐮刀菌孢子的萌發均具有一定的抑制效果。在含有A3培養基中的孢子萌發率最低，其次是含α-松油醇，最后是含1，8-桉葉油素的培養基。

2.3.3 對尖孢鐮刀菌細胞膜滲透性影響 由圖3可知，隨著餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素抑菌成分的濃度增加，尖孢鐮刀菌菌液中電導率均顯著上升;未經抑菌成分處理的對照組電導率變化幅度不大。其中餾分A3的電導率值最大為69.03μS/cm，說明餾分A3中的化學成分之間協同抑菌效果明顯，離子外流量最大。電導率的變化說明抑菌成分改變了菌體細胞膜的通透性，直接導致了菌體內部物質（如鉀離子、鈉離子等）的大量流出，影響了供試菌的正常生長，從而達到了抑菌目的。

2.3.4 對尖孢鐮刀菌還原性糖含量的影響 由圖4可知，從第0h開始，經過對餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素與對照組（CK）處理后，尖孢鐮刀菌菌懸液中的還原性糖含量均呈現出先減少后上升的趨勢，其原因可能是尖孢鐮刀菌對數期大量繁殖消耗了還原糖使其減少;隨后由于餾分A3及其主要單體成分分別抑制了尖孢鐮刀菌的生長繁殖，同時破壞尖孢鐮刀菌的菌體細胞膜，使分子質量較大的還原糖得以通過細胞膜滲出等因素，導致還原性糖含量上升。

2.3.5 對尖孢鐮刀菌蛋白質含量的影響 由圖5可知，分別經餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素作用后的尖孢鐮刀菌菌液中的蛋白質含量較不加抑菌成分作用的菌液稍高，在同一濃度下（150mg/L），餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素分別隨著時間的增加，菌液中蛋白質含量均呈現減少的趨勢，其原因可能如下：一是由于隨著時間的延長，抑菌成分的作用效果降低，同時其余的尖孢鐮刀菌仍在繼續生長，菌液中的蛋白質被正在生長的尖孢鐮刀菌消耗;二是由于菌體自身對細胞膜進行了修復，導致蛋白質的滲漏量減少，滲出的蛋白質不足以抵消菌液中蛋白質的消耗量。在150mg/L時，餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素分別作用8h，菌液中蛋白質含量分別達到13.82%、12.63%和11.97%。

2.3.6 對尖孢鐮刀菌ATP酶活性的影響 由圖6可知，在0～2h內，餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素與對照組（CK）4種處理均使尖孢鐮刀菌內ATP酶活性下降，其原因可能是在初始時ATP酶用于分解ATP釋放能量以維持尖孢鐮刀菌生長，從而使ATP酶活性下降;在2～4h內，尖孢鐮刀菌內ATP酶活性均呈現增大的趨勢，其原因可能是該階段是ATP合成階段，消耗ATP酶較少;在4h后由于受到餾分A3、α-松油醇和1，8-桉葉油素的作用而使ATP活性降低，可能是因為此時ATP合成量的減少，相應地ATP酶含量也表現為下降的趨勢。

3 討論與結論

油樟葉精油3個餾分中主要含有醇類化合物和烴類化合物，這些化合物被廣泛應用于香精香料、制藥及食品工業等領域。如1，8-桉葉油素是世界10大精油品種之一，具有抗菌[14-15]、殺蟲[16]、疏風解熱、祛濕解毒等作用，同時也對多種藥物具有良好的透皮滲透作用[17]。α-松油醇可用于香精的配制以及醫藥、農藥、塑料、肥皂等工業中，是玻璃器皿上色彩的優良溶劑[18-19]。α-蒎稀是合成樟腦、松油醇、香料、樹脂等化工產品的重要原料之一，具有較好的抗腫瘤、抗真菌、抗過敏及改善潰瘍等生物活性及獨特的反應多樣性[20]。此外，油樟葉精油餾分中還含有一些化學成分，其功效目前尚未明確，有待于進一步研究。

從天然植物精油中分離純化抑菌活性物質，并將其直接運用到防治，得到一種既有效控制農作物病原真菌病害又不至于對環境及其它生物造成傷害的藥劑，這不僅能拓寬豐富的植物精油資源的用途，又能開創農作物病害生物防治的新途徑[2]。油樟屬于樟科樟屬植物，富含有精油。本試驗對油樟葉精油餾分A3及其主要單體成分進行抑菌研究，結果顯示，餾分A3及主要單體成分均具有一定的抑菌活性，又以餾分A3效果最好，可能是由于餾分A3多種抑菌成分協同抗菌作用的結果，因此，可作為一種有待開發的新型殺菌物質進行研究。

油樟葉精油餾分A3及其主要單體成分能夠使尖孢鐮刀菌菌絲的生長、孢子的萌發、電導率、還原性糖、蛋白質以及ATP酶的活性發生較明顯的變化，但發生明顯變化的突變點各不相同。當尖孢鐮刀菌遇到抑制生長作用時，細胞膜結構遭到破壞，菌體的保護被打破，其內部小分子物質會外滲入，導致培養液的電導率升高;隨著抑菌物質作用時間的延長，中等分子量的還原性糖隨菌體細胞結構的破壞游離到菌液中;經一定時間作用后，菌體的細胞結構完全被破壞，致使蛋白質等大分子物質也全部溶于菌液中，同時ATP酶的活性也發生相應的變化，進而達到抑制菌體的作用。

我國油樟葉資源較為豐富，資源浪費現象卻十分嚴重。要解決我國油樟葉資源的綜合開發利用的問題，精深加工是關鍵。本試驗對油樟葉精油餾分A3及其單體成分抗菌活性與機理的研究，進一步加深了油樟作為芳香類藥材開發利用的廣度和深度，對提高油樟產品的附加值，促進當地經濟發展具有重要的現實意義。

參考文獻

[1]Sellamuthu PS，Sivakumar D，Soundy P，et al.Essential oil vapours suppress the development of anthracnose and enhance defence related and antioxidant enzyme activities in avocado fruit[J].Postharvest Biology and Technology，2013，81：66-72.

[2]寧蕾，鄧業成，雷玲，等.5種植物精油對植物病原真菌的抑菌活性[J].農藥，2012，51（5）：377-389.

[3]四川植物志編委會.四川植物志（第1卷）[M].成都：四川人民出版社，1979.

[4]Li L，Shi CF，Yin ZQ，et al.Antibacterial activity of α-terpineol may induce morphos tructural alterations in Escherichia coli[J].Brazilian Journal of Microbiology，2014，45（4）：1409-1413.

[5]王濤，游玲，魏琴，等.油樟內生細菌的多樣性及抑制植物病原菌初步研究[J].西北林學院學報，2009，24（2）：97-100.

[6]Du YH，Feng RZ，Li Q，et al.Anti-inflammatory activity of leaf essential oil from Cinnamomum longepaniculatum（Gamble）N.Chao[J].International Journal of Clinical and Experimental Medicine，2014，7（12）：5612-5620.

[7]叢贏，張琳，祖元剛，等.油樟（Cinnamomum longepaniculatum）精油的抗炎及抗氧化活性初步研究[J].植物研究，2016，36（6）：949-954.

[8]曹玫，賈睿琳，江南，等.油樟葉揮發油的鎮痛活性研究[J].廣西植物，2013，33（4）：552-555.

[9]葉奎川，殷中瓊，魏琴，等.油樟葉揮發油及其主要成分的體外抗肝癌活性[J].解剖學報，2012，43（3）：381-386.

[10]陳年春.農藥生物測定技術[M].北京：北京農業大學出版社，1990：66-68.

[11]張夢宇，孫佳文，崔志波，等.三種精油對青霉抑菌效果的研究[J].微生物前沿，2018，7（4）：165-171.

[12]劉歡，夏光輝，溫春野.復配精油對采后葡萄灰霉菌抑制作用的研究[J].食品工業科技，2014，35（21）：115-122.

[13]王學奎，黃見良.植物生理生化實驗原理與技術[M].北京：高等教育出版社，2015：171-184.

[14]?im?ek M，Duman R.Investigation of effect of 1，8-cineole on antimicrobial activity of Chlorhexidine Gluconate[J].Pharmacognosy Research，2017，9（3）：234-237.

[15]Castro KNC，Canuto KM，Brito ES，et al.In vitro efficacy of essential oils with different concentrations of 1，8-cineole against Rhipicephalus （Boophilus） microplus[J]. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária，2018，27（2）：203-210.

[16]Liang JY，Wang WT，Zheng YF，et al.Bioactivities and chemical constituents of essential oil extracted from Artemisia anethoides against two stored product insects[J].2017，66（1）：71-76.

[17]Casey AL， Karpanen TJ，Conway BR，et al.Enhanced chlorhexidine skin penetration with 1，8-cineole[J].BMC infectious diseases，2017，17：350-354.

[18]Zhou HE，Tao NG，Jia L.Antifungal activity of citral，octanal and α-terpineol against Geotrichum citri-aurantii[J].Food Control，2014，37：277-283.

[19]Souza RHL，Cardoso MSP，Menezes CT.Gastroprotective activity of α-terpineol in two experimental models of gastric ulcer in rats[J].DARU Journal of Pharmaceutical Sciences，2011，19（4）：277-281.

[20]Lo?iene. K，?vediene. J，Pa?kevi?ius A.Influence of plant origin natural α-pinene with different enantiomeric composition on bacteria，yeasts and fungi[J].Fitoterapia，2018，127：20-24.

（責編：張宏民）