SRSF6在非小細胞肺癌中的表達及意義

梅娟娟 利桂河 黃偉華

[摘要]目的 探討富含絲氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達及意義。方法 選取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作為研究對象，按照取材的不同分為非小細胞肺癌組織與相應癌旁組織，采用免疫組化SP法檢測非小細胞肺癌組織與相應癌旁組織中的SRSF6蛋白表達水平，同時分析SRSF6表達與NSCLC患者性別、年齡、臨床分期、是否發生遠處轉移、分化程度之間的關系。結果 SRSF6在NSCLC組織中的陽性表達為（1.65±0.48）%，明顯高于癌旁組織的（0.57±0.23）%，差異有統計學意義（P<0.05）;調查SRSF6與NSCLC患者臨床參數的關系，并根據肺癌組織中的SRSF6表達強度分為-、+、++、+++四組，發現SRSF6表達與NSCLC患者年齡和性別無關，差異無統計學意義（P>0.05），與臨床分期、是否發生遠處轉移和分化程度有關，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 SRSF6在癌旁組織中表達較少，在NSCLC中高表達，為NSCLC的臨床診斷和治療提供理論依據，有助于為臨床治療提供新思路。

[關鍵詞]富含絲氨酸-精氨酸剪接因子;非小細胞肺癌;生存率;臨床特征

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（a）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of serine/arginine-rich splicing factor 6 （SRSF6） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Seventy-five patients with NSCLC admitted to our hospital from January 2013 to January 2017 were selected as the study subjects and divided into non-small cell lung cancer （NSCLC） tissues and corresponding adjacent tissues according to the different samples， the expression of SRSF6 in non-small cell lung cancer （NSCLC） and its adjacent tissues was detected by immunohistochemical SP method， the relationship between the expression of SRSF6 and gender， age， clinical stage， distant metastasis and differentiation of NSCLC was also analyzed. Results The positive expression of SRSF6 in NSCLC tissues was （1.65±0.48）%， which was significantly higher than （0.57±0.23）% in adjacent tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. To investigate the relationship between SRSF6 and clinical parameters of patients with NSCLC， and according to the expression intensity of SRSF6 in lung cancer tissues， SRSF6 was divided into four groups： -， +， ++， +++， it was found that SRSF6 expression was not related to age and sex of patients with NSCLC， and there was no significant difference （P>0.05）. There were significant differences in clinical stage， distant metastasis and differentiation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion SRSF6 is less expressed in adjacent tissues and highly expressed in NSCLC， which provides a theoretical basis for clinical diagnosis and treatment of NSCLC， and helps to provide new ideas for clinical treatment.

[Key words] Serine/arginine-rich splicing factor; Non-small cell lung cancer; Survival rate; Clinical features

肺癌主要為兩種類型的病理分型，即小細胞癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）。其中最常見的是NSCLC，占全部肺癌發病率的80%～85%[1]。盡管近年來我國醫療技術不斷發展，但NSCLC的發病率和死亡率仍未受到明顯控制。目前肺癌的早期診斷仍存在缺陷和不足，導致臨床上僅有20%～25%的NSCLC可獲得早期診斷[2]。因此，通過研究肺癌的發病機制，尋找準確可靠的肺癌早期診斷和治療的標志物，已成為臨床肺癌疾病亟待解決的問題[3]。SR蛋白家族屬于富含絲氨酸-精氨酸的蛋白質，在前體RNA的剪接中起著極其重要的作用，其中富含絲氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）作為SR蛋白家族的主要成員之一，在多種腫瘤中存在著拷貝數擴增的現象[4-5]。本研究選取我院收治的75例NSCLC患者作為研究對象，切除患者癌組織及癌旁組織，采用免疫組織化學染色方法檢測SRSF6表達，并分析SRSF6表達與NSCLC患者臨床參數的關系，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作為研究對象，按照取材的不同分為非小細胞肺癌組織與相應癌旁組織。其中男48例，女27例;年齡35～78歲，平均（56.51±4.28）歲。

納入標準：①經病理或組織學確診為NSCLC，同時實施手術的患者;②對本研究知情同意者;③本研究已經醫院醫學倫理委員會審核批準。排除標準：①存在凝血功能障礙、肝腎功能障礙等放化療禁忌證者;②妊娠或哺乳期患者;③臨床資料不完整者;④合并精神疾病患者;⑤伴有活動性感染及其他腫瘤者。

1.2方法

收集相關病例及患者臨床參數，應用免疫組化的方法對組織中SRSF6的表達進行檢測，具體檢測方法如下。①術中分別取NSCLC組織及癌旁組織，以4%多聚甲醛固定24 h，常規70%、80%、90%、95%及無水乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將脫水后石蠟包埋的組織塊經切片機行5 μm切片，干烤半個小時后置于二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇脫水各10 min，純水洗5 min×2次，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，置于37℃ 3% H2O2中30 min消除內源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，微波爐中抗原修復，冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，5% BSA 37℃孵育30 min，傾去不洗，滴加一抗后置于4℃濕盒過夜，復溫，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加SABC 37℃ 孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加IgG 37℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，DAB顯色，自來水沖洗終止顯色，蘇木素輕度復染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化SP試劑盒（批號：SP-0023）和DAB顯色試劑盒（批號：PW017）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，儀器為萊卡全自動免疫組化儀（徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司，型號：BOND-MAX）、萊卡光學顯微鏡（德國LeicaLASXCore）。

1.3觀察指標及評價標準

采用免疫組化法檢測NSCLC組織與相應癌旁組織中的SRSF6陽性表達，并進行比較;同時分析SRSF6表達與非小細胞肺癌患者性別、年齡、臨床分期、是否發生遠處轉移、分化程度之間的關系。陽性細胞的胞漿呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞計數通過兩階段評分法進行：在光學顯微鏡（400×）下，每個切片選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，總計500個。計算每個切片的陽性細胞百分比：陽性細胞數≤5%，0分;5%～<25%，1分;25%～<50%，2分;50%～<75%，3分;≥75%，4分。染色強度：淡黃色1分;棕黃色2分;棕褐色3分。兩者相加：0～1分為陰性（-）;>1～3分為弱陽性（+）;>3～5分為中度陽性（++）;>5～7分為強陽性（+++）[6-7]。

1.4統計學方法

采用統計學軟件SPSS 19.0分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料以率表示，采用χ2檢驗;多因素分析采用Logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1免疫組化法檢測SRSF6在癌旁組織及NSCLC組織中的陽性表達

SRSF6在NSCLC組織和癌旁組織中均有表達。在NSCLC原發灶組織中SRSF6一般呈彌漫性、失極性表達，染色的程度增高，且大部分位于細胞膜與細胞漿中;在癌旁組織中僅在遠曲小管與集合管細胞的細胞膜與細胞漿中存在表達，染色的強度為弱陽性（圖1）。SRSF6在NSCLC癌組織中的陽性表達為（1.65±0.48）%，明顯高于癌旁組織的（0.57±0.23）%，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 SRSF6表達與NSCLC患者臨床參數的關系

根據肺癌組織中的SRSF6表達強度分為-、+、++、+++四組，SRSF6表達與NSCLC患者年齡和性別無關，差異無統計學意義（P>0.05），與臨床分期、是否發生遠處轉移和分化程度有關，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3 SRSF6表達與NSCLC患者相關指標的多因素分析

SRSF6表達與NSCLC患者的臨床分期、是否發生遠處轉移和分化程度有關，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

3討論

近年來，隨著手術改進和麻醉技術的不斷發展與創新以及新型化療藥物的不斷問世，肺癌的綜合治療技術已逐漸成熟，但在過去的50年中，肺癌的5年生存率并未得到顯著提高，肺癌的死亡率在5年內仍高達85%[8]。相關研究提出，若能有效提高肺癌的早期診斷，可明顯改善肺癌的治療和預后效果[9]。目前，經過多年肺癌的診斷和治療經驗以及肺癌相關研究的進展，逐漸形成了結構圖像、功能影像學檢查、痰細胞學、內鏡檢查、臨床癥狀性肺癌的診斷模型，最終以組織病理學檢查為診斷的金標準，可有效調節和指導肺癌的診斷和治療，提高肺癌的診治水平[10-12]。然而，目前對于無癥狀肺癌，仍缺乏有效的早期診斷方法，這是目前導致肺癌死亡的主要原因[13]。因此，臨床將早期NSCLC地診斷及預后評估作為NSCLC防治的重要內容。SR蛋白家族屬于絲氨酸-精氨酸富集蛋白，其在前體RNA的剪接過程中發揮著極為重要的作用，SR蛋白能夠識別結合前體RNA上的剪接元件，繼而招募組裝剪接體，促進或抑制剪接事件的發生[14-15]。腫瘤中，SR蛋白的異常表達導致RNA異常剪接，從而促進腫瘤細胞的增殖及遷移，抑制腫瘤的凋亡。近期報道[16]，作為經典的SR蛋白，剪接因子SRSF6屬于一個癌基因，能夠調控大量的下游基因發生異常的可變剪接，在廣泛的腫瘤相關機制中發揮著重要的作用。此外，其他的SR蛋白家族成員也與腫瘤的發生與發展存在著密不可分的聯系。例如，SRSF6在肝癌中高表迗，并且與腫瘤的進程相關;在結腸癌以及卵巢癌中，高表迖的SRSF6與腫瘤細胞的轉化以及生長相關;SRSF6被報道與血管內皮生長因子（VEGF）兩種不同功能的轉錄本（促血管生成轉錄本VEGF165以及抑血管生成轉錄本VEGF165）表達相關。以上結果提示SR蛋白可以作為腫瘤的重要的檢測指標。

SRSF6作為SR蛋白家族的主要成員之一，在皮膚癌中，高表達水平SRSF6能夠導致細胞黏合素C（TNC）基因的異常可變剪接，從而促進皮膚癌的增殖[17]。谷雪梅等[18]在結直腸癌的研究中發現，SRSF6在結直腸癌高表達，并通過調控ZO-1的表達，影響癌細胞侵襲及轉移，進而影響結直腸癌的治療效果及預后。本研究進一步調查SRSF6在NSCLC中的表達及意義顯示，SRSF6在NSCLC原發灶組織中彌漫性高表達，在癌旁肺組織中低表達;調查SRSF6與NSCLC患者臨床參數的關系，并根據肺癌組織中的SRSF6表達強度分為-、+、++、+++四組，發現SRSF6表達與NSCLC患者的年齡和性別無關，差異無統計學意義（P>0.05），與臨床分期、是否發生遠處轉移和分化程度有關，差異有統計學意義（P<0.05），提示Ⅳ期、淋巴結轉移以及中高分化是SRSF6陽性表達的主要影響因素。檢測SRSF6的表達對于評估肺癌發生發展的生物學行為具有一定的參考價值，在評估手術預后時將腫瘤分化程度與SRSF6表達強度相互結合，可能會達到更好的評估效果。

綜上所述，SRSF6在癌旁組織中表達較少，在NSCLC中高表達，為NSCLC的臨床診斷和治療提供理論依據，有助于為臨床治療提供新思路。

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（收稿日期：2019-01-22? 本文編輯：劉克明）