FSTL1促進間歇性低氧誘導的肺成纖維細胞活化

徐雷倩，曹 潔

（天津醫科大學總醫院呼吸科，天津300052）

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）是以睡眠過程中頻繁的呼吸暫停、血氧飽和度下降和睡眠紊亂為主要特征的臨床綜合征[1]。OSAS對機體的危害是多系統的，除了呼吸系統外，還包括心腦血管、神經系統、泌尿系統以及內分泌系統等，嚴重者易出現夜間猝死的情況，這些并發癥與OSAS的間歇性低氧密切相關。OSAS與呼吸系統疾病密不可分，臨床上將兩者共患稱為重疊綜合征。肺心病是其中最為突出的一個疾病，患者往往有嚴重的肺動脈高壓和右心衰竭[2]。由于呼吸功能障礙，夜間長時間的呼吸暫停，使得急性呼吸衰竭的發生率升高，出現嚴重呼吸困難、發紺、抽搐等表現[3]。另外肺纖維化的發生發展也與OSAS相關，可能原因是間歇性低氧對肺成纖維細胞的活化作用。對于阻塞性睡眠呼吸暫停的治療以呼吸機治療為主，用于擴張氣道，減少夜間呼吸事件的發生，防止過低的通氣導致的夜間猝死和并發癥[4]。氧化應激在OSAS進程中具有十分重要的作用，它能與TGF-b、NF-kb、AMPK等多種信號通路相互聯系，共同促進疾病的發生發展。Fstl1最初是從TGF-b1誘導的小鼠成骨細胞系MC3T3中克隆得到，其編碼一個胞外分泌的小分子糖蛋白。最近的研究發現FSTL1在特發性肺纖維化以及矽肺等纖維化疾病中是一個新的促纖維化因子。Fstl1能夠通過增強TGF-b信號而促進肺成纖維細胞的活化，以及膠原和纖連蛋白等細胞外基質（ECM）的沉積，最終加劇肺纖維化的發展。利用Fstl1基因敲除小鼠或者FSTL1蛋白的中和性抗體阻斷體內FSTL1的生物學功能則能夠減緩肺纖維化的嚴重程度[5]，說明Fstl1可能是纖維化肺疾病的一個重要靶點。目前，Fstl1與OSAS以及其并發癥是否相關并沒有相關研究。睡眠呼吸暫停的突出特征是夜間鋸齒樣的血氧波動，而間歇性低氧成為OSAS體外細胞模型的主要控制因素[6]，OSAS所造成的間歇低氧可導致氧化應激反應，而肺纖維化的發生發展和肺成纖維細胞的的活化也離不開氧化應激的作用[7]，所以OSAS的間歇低氧可能會引起肺成纖維細胞的活化，包括細胞外基質的沉積和氧化應激產物的表達[8]，而這種活化又與FSTL1相關。本研究主要探討OSAS模式下的間歇低氧（IH）引起的氧化應激反應與FSTL1蛋白之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠原代肺成纖維細胞，胎牛血清（FBS），DMEM培養基，胰蛋白酶（美國Gibco公司），抗氧化劑Temple（Sigma公司），CAT試劑盒（南京建成公司），MDA試劑盒(南京建成公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10% FBS的DMEM培養基對小鼠原代肺成纖維細胞進行培養，并放在濕度合適、溫度37℃、5% CO2的培養箱內。直至細胞在培養皿內生長到80%～90%且細胞狀態良好，移除皿內培養基，用PBS小心清洗2遍，再加入1 mL的0.25%的胰蛋白酶消化，加入適量培養基，混勻吹打后，按2mL/孔的細胞量接種于P60細胞培養皿內，至成纖維細胞長到80%～90%，PBS沖洗，轉移至撤去血清的培養基。

1.2.2 間歇低氧處理細胞 把分好盤的小鼠肺成纖維細胞放置于間歇低氧實驗設備內，通過電路板和計算機程序（天津醫科大學總醫院呼吸科呼吸仿真系統）控制低氧/再氧合的循環（包括循環次數和循環時間）。間歇低氧的頻率為：低氧90s，復氧120s，用測氧儀調整低氧時實驗設備內的氧濃度最低限度為5%，復氧時的氧濃度為21%，間歇低氧組細胞分別給予1、3、6、8 h的低氧再氧合的循環操作，對照組細胞放置在適宜的培養箱中培養8 h。

1.2.3 收集細胞分泌液，將上清液裝入EP管中，再加入適當裂解液，用刮板輕刮培養皿，將細胞裝入EP管中，均置于冰上待用。

1.2.4 提取胞內蛋白，用全光譜酶標儀分別在450 nm、532 nm 處測過氧化氫酶（CAT），丙二醛（MDA）的吸光值，通過曲線換算，計算細胞內含量。

1.2.5 分別提取上清內蛋白和胞內蛋白，用Western blot方法，檢測FSTL1和α-SMA表達的差異性以及趨勢變化。

1.2.6 用siRNA轉染的方法沉默成纖維細胞中FSTL1蛋白翻譯，并同樣間歇低氧處理8 h后，提取上清內蛋白做Western blot，驗證是否沉默了FSTL1，提取胞內蛋白，再次用全光譜酶標儀測CAT、MDA的吸光值，通過曲線換算，計算細胞內含量。用提取的胞內蛋白和上清蛋白，通過Western blot方法檢測Collagen 1蛋白和α-SMA蛋白的表達。沉默Fstl1的SiRNA 序列為 Sense：CCAUCAACAUCACCACUUATT，Anti-sense：UAAGUGGUGAUGUUGAUGGTT；對照組的 SiRNA 序列為 Sense：UUCUCC GAACGUGUCACGUTT，Anti-sense：ACGUGACACG UUCGGAGAATT。所有的序列都是5′端到3′端。

2 結果

2.1 間歇低氧模式誘導氧化應激反應 見圖1。間歇低氧模式是一種利用正常氧濃度和低氧濃度交替循環來模擬睡眠呼吸暫停綜合征夜間低氧的方法，之前的研究表明，間歇低氧模式能夠誘導氧化應激反應，檢測的指標主要有丙二醛（MDA）含量，過氧化氫酶（CAT）活力等。為了檢驗間歇低氧模式下誘導的氧化應激反應，我們將小鼠肺成纖維細胞置于呼吸仿真系統倉內，模擬間歇性低氧，檢測不同時間點細胞中過氧化氫酶活力以及丙二醛的含量。我們發現對照組的過氧化氫酶活力和丙二醛含量最低，而隨著低氧處理時間的增加，過氧化氫酶活力和丙二醛含量都呈現明顯上升趨勢。當在細胞培養基中加入抗氧化劑Temple處理8 h后，過氧化氫酶活力和丙二醛含量都顯著下降了。以上實驗說明間歇低氧模式確實能誘導氧化應激反應，并且與間歇低氧的時間成正相關性。

圖1 小鼠肺成纖維細胞在低氧模式下氧化應激產物CAT和MDA的表達Fig 1 Expression of oxidative stress products CAT and MDA in mouse lung fibroblasts in hypoxia mode

2.2 間歇低氧模式誘導肺成纖維細胞中Fstl1的表達 見圖2。利用Western Blot方法檢測不同時間點經過間歇低氧處理的肺成纖維細胞中α-SMA和FSTL1的蛋白水平。結果顯示，α-SMA蛋白水平隨著低氧處理時間增加而明顯增加，同時FSTL1蛋白的表達量在對照組中最低，隨著間歇低氧處理時間越長，其表達量越高，而經過抗氧化劑temple處理后，α-SMA和FSTL1蛋白的表達量都有明顯下降。以上數據說明間歇低氧能夠誘導肺成纖維細胞活化以及FSTL1蛋白的表達，并且與氧化應激反應具有一定相關性。

圖2 小鼠肺成纖維細胞在低氧模式下α-SMA和FSTL1的表達Fig 2 Expression of α-SMA and FSTL1 in mouse lung fibroblasts in hypoxic mode

2.3 敲低Fstl1減弱間歇低氧模式誘導的氧化應激反應 見圖3。我們利用Fstl1的siRNA敲低肺成纖維細胞中FSTL1的蛋白，Western blot顯示，siRNA確實降低了FSTL1蛋白的水平。而間歇性低氧處理后，細胞內丙二醛含量和過氧化氫酶活力都明顯下降了。說明Fstl1參與調節間歇低氧模式的氧化應激過程。

圖3 敲低FSTL1表達后小鼠肺成纖維氧化應激產物CAT和MDA的表達Fig 3 Expression of CAT and MDA in lung fibroblastic stress products of mice after knockdown of FSTL1 expression

2.4 敲低Fstl1減弱間歇低氧模式誘導的肺成纖維細胞活化 見圖4。筆者進一步檢測了在Fstl1表達下降的情況下，間歇低氧處理后肺成纖維細胞中α-SMA蛋白以及培養基中細胞外基質college1的表達量。結果顯示，α-SMA蛋白以及collegen1的含量都顯著下降，表明敲低Fstl1減弱間歇低氧模式誘導的肺成纖維細胞活化以及細胞外基質的合成。

圖4 敲低FSTL1表達后小鼠肺成纖維細胞活化程度Fig 4 Activation of lung fibroblasts in mice after knockdown of FSTL1 expression

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征是一種由多種原因引起的睡眠呼吸疾病，造成夜間的低通氣和白天嗜睡現象，臨床上常見的原因是上呼吸道的狹窄。長期的夜間呼吸暫停和低通氣，使得機體缺氧，血液系統、神經系統、內分泌系統等全身各個系統都受到間歇性低氧的影響，這種危害是廣泛而且不可逆的，甚至常發生夜間猝死現象。該疾病的治療方法主要有手術和非手術兩種[9]，非手術治療中以經鼻持續正壓通氣（NCPAP）最為有效，手術治療的目的是消除或減輕呼吸道的阻塞，但這種方法個體性較強，有時不能完全治愈，會出現病情復發。FSTL1（Follistain-like 1）基因編碼一種胞外分泌的糖蛋白，其幾乎在所有的組織器官中均有表達[10]。研究表明，FSTL1通過增強TGF-b信號而促進肺纖維化的發展，是一個新的促纖維化因子。然而FSTL1是否參與氧化應激反應誘導的肺成纖維細胞活化并沒有相關研究。有研究報道，Fstl1在特發性肺纖維化以及矽肺的活化肺成纖維細胞中均有明顯上調。在之前的研究中發現，間歇性低氧能夠誘導小鼠肺成纖維細胞的活化。本實驗發現，經過間歇低氧處理后的FSTL1和α-SMA表達都高于正常組，且與低氧處理時間呈正相關[5，11-15]。用siRNA轉染沉默FSTL1蛋白的表達，間歇低氧處理8 h后，α-SMA和collagen 1的表達量相較正常組都降低，氧化應激指標過氧化氫酶活力和丙二醛含量都下降，這在一定程度上表明FSTL1蛋白參與了此氧化應激的過程，與成纖維細胞的活化相關，有可能起到了促炎的作用?？偟膩碚f，睡眠呼吸暫停是一種全身性的疾病，對多個系統都有廣泛影響，而這種影響體現在間歇低氧的這一機制對系統的損害，應該引起更多臨床醫生和科研工作者的重視。特別是OSAS患者是否有更高的發生肺纖維化的風險或者更嚴重的肺纖維化。接下來，應該完善從具體的氧化應激相關通路上做進一步的分析，嘗試從信號分子上探索FSTL1蛋白和間歇低氧模式的關系，并搜集大量臨床數據分析OSAS是否為肺纖維化的獨立危險因素。