水芹總酚酸體外抗HBV作用及其機制探討

劉青川 王盼麗 楊新波 王仁杰 王蒙蒙 黃正明

[摘要] 目的 觀察水芹總酚酸體外對乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用并探討其作用機制。 方法 水芹總酚酸對Hep AD38細胞的毒性實驗分為水芹總酚酸組（細分為1600、800、400、200、100 μg/mL濃度組）和空白對照組。體外培養Hep AD38細胞，用MTT法檢測水芹總酚酸的毒性范圍。水芹總酚酸體外抗HBV作用實驗分為水芹總酚酸組（細分為200、100、50、25 μg/mL濃度組）、陽性對照組[恩替卡韋（ETV） 10 μmol/L]和病毒對照組。用無毒濃度以下的水芹總酚酸藥液處理Hep AD38細胞，連續6 d，收取上清和細胞，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測上清中HBsAg、HBeAg滴度;實時熒光定量PCR方法檢測細胞內HBV DNA載量。水芹總酚酸對鴨乙型肝炎病毒（DHBV）DNA聚合酶的影響實驗分為水芹總酚酸組（細分為400、200、100、50、25 μg/mL濃度組）、陰性對照組和DHBV DNA聚合酶對照組。從感染鴨乙肝病毒的鴨肝中提取DHBV DNA聚合酶，分別給予不同濃度水芹總酚酸藥液，采用ELISA法檢測水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶活性的影響。 結果 水芹總酚酸對Hep AD38細胞的無毒濃度為400 μg/mL。與病毒對照組比較，水芹總酚酸組中的200、100、50 μg/mL濃度組的HBsAg、HBeAg滴度和HBV DNA載量均明顯降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與DHBV DNA聚合酶對照組比較，水芹總酚酸組中的400、200、100 μg/mL濃度組可抑制DHBV DNA聚合酶活性，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 水芹總酚酸體外具有良好的抗HBV作用，其作用機制包括抑制HBV DNA聚合酶的活性。

[關鍵詞] 水芹總酚酸;Hep AD38細胞;乙型肝炎病毒;乙肝病毒DNA聚合酶

[中圖分類號] R965 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）10（a）-0012-06

Study on anti-HBV effect of total phenolics acid from Oenanthe Javanica in vitro and its mechanism

LIU Qingchuan1 ? WANG Panli2 ? YANG Xinbo1 ? WANG Renjie1 ? WANG Mengmeng1 ? HUANG Zhengming1

1.Beijing Weijian Jiye Institute of Biotechnology， Beijing ? 100039， China; 2.Department of Pharmacy， People′s Hospital of Shigatse， Tibet Autonomous Region， Xigaze ? 857000， China

[Abstract] Objective To observe the inhibitory effect of total phenolics acid from Oenanthe Javanica on hepatitis B virus （HBV） in vitro and explore its mechanism. Methods The toxicity of total phenolics acid from Oenanthe Javanica to Hep AD38 cells was divided into the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group （subdivided into 1600， 800， 400， 200， 100 μg/mL concentration groups） and the blank control group. Hep AD38 cells were cultured in vitro and the toxicity range of total phenolics acid from Oenanthe Javanica was determined by MTT assay. In vitro anti-HBV effects of total phenolics acid from Oenanthe Javanica were divided into the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group （subdivided into 200， 100， 50 and 25 μg/mL concentration groups）， the positive control group [Entecavir （ETV） 10 μmol/L] and the virus control group. Hep AD38 cells were treated with total phenolics acid from Oenanthe Javanica solution with a concentration below the non-toxic concentration for 6 consecutive days. The supernatant and cells were collected. The titer of HBsAg and HBeAg in the supernatant was detected by enzyme linked immune sorbent assay （ELISA）. The intracellular HBV DNA load was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The effects of total phenolics acid from Oenanthe Javanica on duck hepatitis B virus （DHBV） DNA polymerase were divided into the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group （subdivided into 400， 200， 100， 50 and 25 μg/mL concentration groups）， the negative control group and the DHBV DNA polymerase control group. DHBV DNA polymerase was extracted from duck liver infected with duck hepatitis B virus， different concentrations of total phenolics acid from Oenanthe Javanica solution were given， and the effects of total phenolics acid from Oenanthe Javanica on DHBV DNA polymerase activity were detected by ELISA. Results The non-toxic concentration of total phenolics acid from Oenanthe Javanica in Hep AD38 cells was 400 μg/mL. Compared with the virus control group， HBsAg， HBeAg titer and HBV DNA load were significantly decreased in the 200， 100 and 50 μg/mL concentration groups of the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the DHBV DNA polymerase control group， DHBV DNA polymerase activity was inhibited in the 400， 200， and 100 μg/mL concentration groups of the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Total phenolics acid from Oenanthe Javanicahas a good anti-HBV effect in vitro， and its mechanism includes inhibition of HBV DNA polymerase activity.

[Key words] Total phenolics acid from Oenanthe Javanica; Hep AD38 cells; Hepatitis B viral; Hepatitis B viral DNA polymerase

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的可能威脅生命的肝臟感染，可分為急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎，是全世界引起肝炎性死亡人數最多的疾病。據2017年WHO發布的《全球肝炎報告》數據顯示，2015年全球有2.57億乙肝病毒感染者，占世界人口的3.5%，其中乙型肝炎導致88.7萬人死亡，大多死于并發癥（包括肝硬化和肝細胞癌）。雖然這一系列數字較往年有下降趨勢，但乙型肝炎仍是一個嚴重的全球衛生問題。

作為傳統醫學，中藥用于治療乙型肝炎有著兩千多年的歷史，多部著名醫藥典籍中均有收錄對于治療乙型肝炎效果確切的中草藥，其中水芹就出自《本草綱目》，近代藥理學研究也發現其具有很好的抗肝炎作用[1]。水芹總酚酸是從水芹全草中提取，經過多年的研究發現，水芹總酚酸對乙肝病毒具有穩定的抑制作用，可降低Hep G2.2.15細胞上清中乙肝表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的滴度，抑制細胞內HBV DNA的復制[2-3]。體內實驗發現水芹總酚酸可有效抑制鴨血清中鴨乙型肝炎病毒（DHBV）DNA的復制，且停藥后無反跳現象[4]。此外，水芹總酚酸還具有保肝降酶和退黃的作用[5]。由此可見，水芹總酚酸治療乙型肝炎的臨床開發前景可觀。本研究采用Hep AD38細胞模型來驗證水芹總酚酸抗HBV活性，建立DHBV DNA聚合酶活性的檢測方法，并通過檢測DHBV DNA聚合酶的活性探討其抗HBV的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和動物

Hep AD38細胞是人肝細胞腫瘤細胞系，在四環素的調控下產生HBV。北京麻鴨，1～2日齡，購自北京前進種鴨場，飼養于解放軍總醫院第五醫學中心SPF級實驗動物中心，清潔級別為普通級，籠具用過氧乙酸溶液消毒，飲用水為消毒水，室溫恒為25℃，相對濕度為40%～70%。

1.2 主要試劑和儀器

水芹總酚酸，北京衛健基業生物技術研究所提取精制（批號：20180312）;恩替卡韋（ETV），解放軍總醫院第五醫學中心肝衰竭研究室饋贈;DME/F-12（HyClone，貨號：SH30023.01）;FBS（Corning，貨號：35-010-CVR）;MTT（AMRESCO，貨號：0793）;QuickExtract DNA Extraction Soln 1.0提取液（美國Epicentre）;HBV DNA TaqMan熒光定量檢測試劑盒（北京巴奧瑞生物科技有限公司，批號：20180512）;HBsAg、HBeAg酶聯免疫試劑盒（北京科華生物技術有限公司，批號：201708151）;牛血清白蛋白（BSA）（AMRESCO，貨號：0332）;Bio-dUTP，上海生工合成;dTTP，Oligo（dT）15及其他相關引物，大連寶生物合成;堿磷酶標記鏈親合素（APS）（北京中杉金橋生物技術有限公司）;BCA蛋白含量測定試劑盒（Pierce公司，貨號：23228）;EDC（J&K公司）;DTT、poly A、PNPP（Sigma）。二氧化碳培養箱，美國Thermo公司;96孔細胞培養板，美國Corning公司;倒置顯微鏡，日本Olympus公司;低溫高速離心機，美國Thermo公司;實時電子分析天平，上海天平儀器廠;酶聯儀，美國Bio-RAD公司;生物安全柜，美國Thermo公司;實時熒光定量PCR儀 SLAN 8.0，上海宏石醫療科技有限公司;NH微孔板，Nunc公司;漩渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;恒溫水浴鍋，Grant公司;智能超速離心機，美國Beckham公司。

1.3 實驗分組及處理

①水芹總酚酸對Hep AD38細胞的毒性實驗分為水芹總酚酸組（細分為1600、800、400、200、100 μg/mL濃度組，同時由于水芹總酚酸本身呈褐色，每個濃度藥液設1個本底對照孔）和空白對照組;②水芹總酚酸體外抗HBV作用實驗分為水芹總酚酸組（細分為200、100、50、25 μg/mL濃度組），陽性對照組（ETV 10 μmol/L）和病毒對照組;③水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶的影響實驗分為水芹總酚酸組（細分為400、200、100、50、25 μg/mL濃度組），陰性對照組和DHBV DNA聚合酶對照組。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 水芹總酚酸對Hep AD38細胞毒性的影響

Hep AD38細胞接種至96孔板中，分別給予各濃度組別的藥液，每孔0.2 mL，每濃度3孔，同法設置培養液空白對照組。給藥3 d，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育6 h后，吸出培養液，沉淀用二甲基亞礬（DMSO）溶解，于490 nm處檢測吸光度。

1.4.2 水芹總酚酸對Hep AD38細胞內HBV-DNA及上清分泌HBsAg、HBeAg含量的影響

Hep AD38細胞計數達到2×105個細胞/mL時，接種至96孔板中，待細胞貼壁后分別給予各濃度組別的藥液，每孔0.2 mL，每濃度3孔，同法設置陽性對照組（ETV 10 μmol/L）和病毒對照組（培養液）。給藥第3天換同濃度藥液;給藥第6天收集細胞和上清。上清液用酶聯免疫吸附測定（ELISA）實驗檢測試劑盒檢測HBsAg和HBeAg的含量;細胞用DNA快速提取液抽提總DNA，采用HBV DNA TaqMan熒光定量檢測試劑盒檢測細胞內HBV-DNA表達量。PCR體系：待測樣本3 μL，HBV-PCR反應液（OT）30 μL，HBV酶混合物1.5 μL。PCR反應程序：尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG酶）反應37℃ 2 min→95℃ 3 min→[95℃ 10 s→60℃ 35 s（45個循環）]→25℃ 10 s。

1.4.3 水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶活性的影響

1.4.3.1 DHBV DNA聚合酶的提取 ?雛鴨注射DHBV病毒強陽性血清，7 d后取肝，肝勻漿之后利用蔗糖濃度梯度法純化獲得DHBV DNA聚合酶，提取流程如下：取感染DHBV的鴨肝，勻漿;11 000 r/min，4℃離心30 min后取上清;上清45 000 r/min，4℃，離心3 h得到沉淀物;沉淀物用蔗糖濃度梯度離心，按不同的蔗糖濃度分層取出液體;各部分45 000 r/min，4℃，離心10 h得到沉淀，提取物放入-80℃保存。

1.4.3.2 DHBV DNA聚合酶活性檢測 ?將通用引物Oligo（dT）15溶于100 mmol/L的1-甲基-咪唑的鹽酸緩沖液中，加入96孔NH酶標板中，與水溶性碳化二亞胺混勻，于50℃水浴中反應4 h，反應結束后用洗液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗三遍，除去未結合的Oligo（dT）15，將包被后的96孔板置于4℃保存。實驗設水芹總酚酸各濃度藥液、DHBV DNA聚合酶對照組和陰性對照液。水芹總酚酸各濃度藥液分別加入到用磷酸緩沖鹽液（PBS）洗過的96孔培養板中，每孔10 μL（DHBV DNA聚合酶對照組和陰性對照液組以PBS代替），每濃度3孔，然后加入每孔70 μL的RT Buffer[含poly（A）、dTTP、bio-dUTP]，每孔20 μL的含DHBV聚合酶的PBS溶液（陰性對照液組以PBS代替），使反應系統總體積為100 μL。37℃水浴反應1 h，Washing buffer洗板3次，除去未結合的游離底物，再每孔加入100 μL 1% BSA，室溫封閉1 h，Washing buffer洗板3次。每孔加入50 μL的SA-ALP稀釋液（100 ng/mL），37℃水浴1 h，洗板后，每孔再加入100 μL PNPP（1 mg/mL），37℃水浴30 min;每孔50 μL加入1 mol/L的NaOH終止反應，酶標儀測定405 nm波長處吸光度（OD）值，計算化合物在該濃度的抑制率，以確定化合物對DHBV聚合酶的抑制活性。用Reed-Meuench公式計算半抑制濃度（IC50）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水芹總酚酸對Hep AD38細胞的毒性作用

本實驗中，由于水芹總酚酸給藥濃度過高會出現析出現象，故將最高給藥濃度定為1600 μg/mL。檢測結果發現，水芹總酚酸各濃度組扣除本底后，與空白對照組比較，1600 μg/mL濃度組對細胞生長有一定的抑制作用，抑制率為35.62%，其余各濃度組未發現明顯的抑制作用，抑制效果呈現量效關系。結果表明，水芹總酚酸對Hep AD38細胞的毒性較低，半數毒性濃度（TC50）>1600 μg/mL，最大無毒濃度（TC0）為400 μg/mL。見表1、圖1。

2.2 水芹總酚酸對Hep AD38細胞抗HBV的影響

根據水芹總酚酸對Hep AD38細胞的毒性結果，將其藥效學實驗的最高濃度設為200 μg/mL。試驗結果發現，水芹總酚酸給藥第6天時，可以降低Hep AD38細胞上清中HBsAg、HBeAg滴度，200、100、50 μg/mL水芹總酚酸組與病毒對照組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01），25 μg/mL水芹總酚酸組與病毒對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。用標準品質粒PCP10作HBV-DNA擴增曲線和標準曲線，實時熒光定量PCR檢測細胞內HBV-DNA載量。結果顯示，水芹總酚酸各劑量組在給藥6 d后，可以有效地抑制細胞HBV-DNA的復制，200、100、50 μg/mL濃度組與病毒對照組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01），量效關系明顯。見表2、圖2。

2.3 水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶活性的影響

水芹總酚酸對DHBV聚合酶有顯著的抑制作用。抑制率隨著藥物濃度的增大而升高，400、200、100 μg/mL水芹總酚酸組對DHBV聚合酶的平均抑制率分別為93.62%、81.51%、57.50%，呈現明顯的量效關系，與DHBV DNA聚合酶對照組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表3、圖3。

注：與DHBV DNA聚合酶對照組比較，bP < 0.05，cP < 0.01。DHBV DNA：鴨乙型肝炎病毒DNA;IC50：半抑制濃度。“-”表示無數據

3 討論

水芹總酚酸作為水芹生藥中提取的有效部位，具有穩定的提取工藝和質量控制方法。其粗略提取流程為：水芹全草經乙醇加熱回流，放冷過濾，加壓回收溶劑得浸膏，浸膏以熱蒸餾水溶解過濾，得到的水溶液在聚酰胺柱上以乙醇洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮，真空干燥得水芹總酚酸提取物。用Folin-酚法[6]作為水芹總酚酸中總酚酸物質和其代表成分綠原酸的質量控制方法，測定結果發現總酚酸含量>50%，綠原酸含量約為7%。

病毒的生命周期包含吸附、穿入、脫殼、生物合成及裝配分泌等階段，每個階段都有相應的藥物阻斷靶點[7]。近年來抗HBV藥物機制研究較多的靶點有病毒侵入階段的鈉離子-牛磺膽酸協同轉運蛋白（NTPC）[8]，病毒合成階段的共價閉合環狀DNA（cccDNA）、HBV DNA聚合酶[9]、前基因組RNA（pgRNA）[10]、siRNA，病毒裝配階段的核心蛋白[11]以及一些調控蛋白等。水芹總酚酸在之前的研究中已經明確了其抗HBV的活性，但是沒有對其作用機制進行研究。本試驗選用Hep AD38細胞，可以在觀察受試物抗HBV作用活性的同時間接反映出其抗HBV的作用位點，可能為抑制HBV復制周期中的特定步驟或是抑制負責pgRNA轉錄的誘導型啟動子[12]。體外結果提示，水芹總酚酸具有良好的抗HBV活性，作用持久穩定，推測其作用靶點可能是抑制HBV復制周期中的特定步驟。本課題組在對水芹總酚酸抗艾滋病（HIV）的研究中發現其可通過抑制逆轉錄酶的活性阻止HIV復制，而現今臨床常用抗HBV的核苷類似物，其最初的研究方向也是抗HIV，后因發現其可通過抑制HBV DNA聚合酶的活性阻止HBV的復制[13]，將研發重點轉到了HBV領域。此外，HBV DNA聚合酶具有多重功能域，在參與完成HBV DNA合成以及RNA模板降解過程中起重要作用，篩選靶向HBV DNA聚合物的藥物可有效阻斷HBV生命周期[14-16]。綜上考慮，本課題組對水芹總酚酸抗HBV的作用機制重點放在對HBV DNA聚合酶活性的研究。

近年來，HBV DNA聚合酶的檢測方法主要是用同位素標記，以液閃儀測定同位素放射性度（CPM）[17-19]。由于同位素具有很強的放射性，對人體產生很大的輻射作用，國家對其使用把控嚴格，且對實驗室要求較高，不適用于一般科研單位，從而限制了廣大科研工作者的相關研究。目前尚未有文獻報道利用非同位素標記法測定DHBV DNA聚合酶活性。本研究所同北京大學醫學部藥學院共同研究，參考其對HIV-1逆轉錄酶的活性測定方法[20]，建立了非同位素標記測定DHBV DNA聚合酶活性的方法[21]（專利申請號：201810302359.2）。其測定原理為：利用NH微孔板，將Oligo（dT）15引物固定到模板上，通過DHBV DNA聚合酶的活性反應將dTTP和bio-dUTP連接到Oligo（dT）15相連的poly（A）上，利用免疫反應再將堿性磷酸酶連接上去，最后通過化學發光底物PNPP反應使體系顯色。經驗證該檢測方法，檢測靈敏度更高，方法穩定，且更加簡單方便。本研究通過ELISA檢測出水芹總酚酸對HBV DNA聚合酶的IC50為90.71 μg/mL，表明水芹總酚酸是一種作用較強的HBV DNA聚合酶抑制劑。

綜上所述，水芹總酚酸作為一種抗病毒的中藥五類新藥，對乙型肝炎、艾滋病、白血病等病毒的抑制作用明確且穩定，結合其對HBV DNA聚合酶和HIV逆轉錄酶均具有較強的抑制作用[22-23]，可推測水芹總酚酸是一種廣譜抗病毒的酶抑制劑，具有較高抗病毒藥物研究的價值。

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