實時定量PCR在先天性小瞼裂綜合征患者FOXL2基因檢測中的應用

陳麗娟 王中英 李思佳 胡姍姍

[摘要]目的 應用實時定量PCR技術鑒定先天性小瞼裂綜合征（BPES）患者中FOXL2基因的突變和（或）缺失。方法 于2017年8月收集黑龍江省1個BPES患病家系，采集外周血提取基因組DNA，用PCR直接測序法和實時定量PCR法篩查FOXL2基因的全部外顯子。結果 在此例患病家系中，用PCR直接測序法排除了基因內突變，用實時定量PCR方法確定了FOXL2基因全缺失。這些變異在未患病親屬和50名正常人中并未被檢測到。結論 本研究是應用實時定量PCR技術檢測中國BPES患者FOXL2基因缺失的報道，這項技術豐富了BPES患者的分子遺傳學診斷方法。

[關鍵詞]小瞼裂綜合征;叉頭蛋白L2;實時定量PCR;缺失;突變

[中圖分類號] R777.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）8（b）-0079-04

[Abstract] Objective To identify the mutation or deletion of the FOXL2 gene in patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome （BPES） using quantitative real-time PCR technology. Methods A family with BPES was collected in Heilongjiang Province in August 2017. Genomic DNA extracted from peripheral blood was collected from the family. PCR direct sequencing and quantitative real-time PCR sequencing for the whole exon of the FOXL2 gene were performed. Results In this family， deletion of the FOXL2 gene was confirmed by the quantitative real-time PCR technique， which intragenic mutations were excluded by PCR direct sequencing. This change was not detected either in the non-carrier relatives or in 50 normal controls. Conclusion This is the study to report FOXL2 gene deletion detected by quantitative real-time PCR in Chinese BPES patients. This technique enriches the diagnostic methods of molecular genetics in BPES patients.

[Key words] Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome; Forkhead box protein L2; Quantitative real-time PCR; Deletion; Mutation

小瞼裂綜合征（BPES）是一種罕見的遺傳疾病，以眼瞼畸形和卵巢功能不全為特征。依據是否伴有卵巢功能衰竭（POF），本病分為兩種臨床亞型，Ⅰ型患病女性同時患有POF;Ⅱ型則與POF無關[1-2]。BPES主要以常染色體顯性方式遺傳，偶有散發病例和常染色體隱性遺傳方式報道[3]。經細胞重組和連鎖分析研究后，BPES可能致病基因被定位于人類染色體3q23上[4]。隨后，FOXL2（forkhead box protein L2）基因被確定為BPES的致病基因。此外，非綜合征性POF和卵巢粒細胞瘤也相繼報道與FOXL2的基因突變相關[5-6]。

迄今為止，已報道的與BPES患者相關的FOXL2基因突變有200余個。在所有已發現的遺傳缺陷中，約有80%的病例是由于FOXL2基因內部突變所致[7];約2%的病例與細胞染色體的重排相關，包括染色體不平衡易位和3號染色體的中間缺失[8];約12%的病例是源于部分或全部的FOXL2基因長缺失和（或）其鄰近的基因缺失[9];還有5%的病例是由于FOXL2的調控基因缺失[10]。目前有文獻報道，可應用多重連接探針擴增（MPLA）技術[11]檢測FOXL2基因單倍體缺失來證實常染色體顯性遺傳方式的BPES家系是源于FOXL2基因長缺失。本研究應用PCR直接測序法和實時定量PCR法對1個患有BPES中國家系進行FOXL2基因的突變及長缺失篩查。

1對象與方法

1.1實驗對象

于2017年8月收集黑龍江省1個BPES患病家系（F1）。本研究經過牡丹江醫學院醫學倫理委員會批準，遵循赫爾辛基宣言，在知情同意的情況下，對家系中2位患者（先證者及其母親）及1位有血緣關系的正常家系成員（先證者父親）進行病史采集。對其家系患病情況進行系譜分析（3代9名成員，其中患有BPES者3名，未患病成員6名）。同時選取同期在我院體檢中心進行健康檢查的50名正常人，臨床診斷由婦科和生殖科醫師協診，眼科醫師確診，排除其他眼部及系統疾病，且經由患者家屬同意獲取眼部照片。

1.2 PCR測序分析

血樣采自BPES患者及正常家系成員，并且儲存在-20℃的環境里。使用血液基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini kit，Qiagen，Hilden，Germany）抽提基因組DNA。應用聚合酶鏈反應（PCR）方法對FOXL2基因整個外顯子（包括編碼區和側翼序列）DNA序列測定進行突變分析，引物序列如表1所示。

1.3實時定量PCR分析

實時定量PCR的引物由TakaRa生物工程公司設計、合成（引物序列如表2所示）。兩對引物的擴增片段分別位于FOXL2基因的5′和3′端。實時定量PCR的反應體系按SYBR Green PCR Master Mix（TakaRa生物工程公司提供）試劑盒制備，應用7000實時定量PCR儀器進行實驗操作。將位于21號染色體上的C2基因作為目標序列的量化模板。以正常對照組DNA作為校對標準，依據測得的相對循環周期閾值（Ct）來計算樣本的相對拷貝數（RCN）[12]。實驗均重復3遍，以排除人為誤差?；蜷L缺失的判定點為A≈0.5倍RCN的異常。

2結果

2.1臨床表現

本次研究中的先證者（F1-Ⅲ∶3，圖1）為女童，有典型的BPES特征，即瞼裂狹小、上瞼下垂、倒轉型內眥贅皮和內眥距離過寬。但POF需成人后確診。其母親患有BPES，在兒童期已接受過眼瞼矯正術，目前未患POF。該家系未能確定BPES臨床分型。

2.2 PCR測序結果

通過對FOXL2基因的直接測序，排除了家系中的基因內突變。

2.3實時定量PCR結果

通過實時定量PCR技術進一步驗證患者是否存在FOXL2基因的長缺失。研究顯示，患者的RCN約為健康個體的一半（圖2）。實時定量PCR檢測到的產物拷貝數異常（CNVs）即意味著FOXL2基因的長缺失，缺失的長度為兩組引物之間的全部FOXL2基因長度（chr 140148003-140146289）。實驗均重復進行3次，以消除操作誤差。正如實驗設想所示，在BPES家系未患病親屬和50名正常人中均未檢測到FOXL2基因的長缺失。實時定量PCR的兩對外顯子擴增產物表明家系患者的基因拷貝數約為未患病親屬的一半。

3討論

本研究應用實時定量PCR技術在BPES家系（F1）中檢測到了FOXL2基因的長缺失。與熒光原位雜交（FISH）技術和MLPA技術相比，實時定量PCR技術更為方便、快捷。本研究中分別位于FOXL2基因5′端和3′端的兩對引物相對應的擴增片段的拷貝數均接近于健康個體的50%（圖2），這就意味著這兩對引物之間的區域缺失，即FOXL2基因長缺失。據報道，約12%的BPES病例是源于部分或全部的FOXL2基因長缺失和（或）其鄰近的基因缺失，因而缺失篩查應常規應用于BPES的分子診斷領域。Beysen等[10]認為BPES患者FOXL2基因長缺失與POF的發生無相關性，而D′haene等[11]的研究表示，FOXL2的基因缺失可能與卵巢功能不全的嚴重程度相關。本研究試圖在此家系中評估BPES的分型，家系1中患病女童處于青春期前的發展階段，其母親未表現出不孕或是患有POF，意味著FOXL2基因的長缺失未影響其在卵巢中的表達，所以BPES的分型不能被確定。FOXL2基因缺失引起的單倍劑量不足可能影響卵巢功能，導致女孩在以后的某時期患POF。因此，除了眼科的隨診，未確定的表型的年輕女性患者需要密切的內分泌和婦產科的隨診。本研究是通過實時定量PCR技術檢測中國患者FOXL2基因缺失，所以可以確定實時定量PCR可以作為FOXL2的基因缺失篩查的可靠、方便、廉價的分子診斷工具，這能使得BPES患者的基因咨詢工作更加便利，并且能夠幫助擴展女性患者對于POF的臨床隨診。

以往的研究顯示，FOXL2基因內突變產生的截短蛋白質會大量的聚集在細胞核內[13]，這些異常定位和聚集影響FOXL2核內定位，會嚴重損害它自身的DNA綁定功能，進而影響其與其它蛋白質的相互作用。研究顯示，FOXL2突變后轉錄功能的降低不僅與蛋白的異常聚集有關，而且與氨基酸側鏈的位置是否朝向螺旋結構的疏水核密切相關[14]。也有學者認為FOXL2突變受到上下游其他基因的協同控制而發揮作用，影響靶基因的調節[15]，從而導致BPES發生。本研究中的FOXL2基因缺陷引起單倍體劑量不足，導致無效等位基因的產生，并可能導致轉錄物的失效，產生無意義的衰變[16]。由于FOXL2基因羧基末端的完整多聚丙氨酸長鏈對StAR基因（生成類固醇急性調控因子基因）的轉錄有抑制作用[17]，因而FOXL2基因缺失或是失去多聚丙氨酸長鏈的基因突變可以增強StAR的表達，繼而導致BPES和POF的發生，成為BPES的發病機制。

綜上所述，本研究是通過實時定量PCR技術對中國人檢測FOXL2基因缺失，為將實時定量PCR技術作為相對可靠的、便利的和廉價的方法應用于檢測BPES患者遺傳學缺陷提供理論支持。該技術的應用不僅促進了BPES的遺傳學診斷發展，還為患病家系的遺傳學咨詢提供了依據。

[參考文獻]

[1]Gulati R，Verdin H，Halanaik D，et al.Co-occurrence of congenital hydronephrosis and FOXL2-associated blepharophimosis，ptosis，epicanthus inversus syndrome （BPES）[J].Eur J Med Genet，2014，57（10）：576-578.

[2]Nuovo S，Passeri M，Di Benedetto E，et al.Characterization of endocrine features and genotype-phenotypes correlations in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome type 1[J].J Endocrinol Invest，2016，39（2）：227-233.

[3]Chawla B，Bhadange Y，Dada R，et al.Clinical，radiologic，and genetic features in blepharophimosis，ptosis，epicanthus inversus syndrome in the Indian population[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54（4）：2985-2991.

[4]Crisponi L，Deiana M，Loi A，et al.The putative forkhead transcription factor FOXL2 is mutated in blepharophimosis/ptosis/epicanthus inversus syndrome[J].Nat Genet，2001，27（2）：159-166.

[5]Yang XW，He WB，Gong F，et al.Novel FOXL2 mutations cause blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome with premature ovarian insufficiency[J].Mol Genet Genomic Med，2018，6（2）：261-267.

[6]Leung DT，Fuller PJ，Chu S.Impact of FOXL2 mutations on signaling in ovarian granulosa cell tumors[J].Int J Biochem Cell Biol，2016，72：51-54.

[7]Yang L，Li T，Xing Y.Identification of a novel FOXL2 mutation in a single family with both types of blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mol Med Rep，2017， 16（4）：5529-5532.

[8]Yang Y，Yang C，Zhu Y，et al.Intragenic and extragenic disruptions of FOXL2 mapped by whole genome low-coverage sequencing in two BPES families with chromosome reciprocal translocation[J].Genomics，2014，104（3）：170-176.

[9]Bouman A，van Haelst M，van Spaendonk R.Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome caused by a 54-kb microdeletion in a FOXL2 cis-regulatory element[J].Clin Dysmorphol，2018，27（2）：58-62.

[10]Beysen D，Raes J，Leroy BP，et al.Deletion involving long-range conserved nongenic sequences upstream and downstream of FOXL2 as a novel disease-causing mechanism in blepharophimosis syndrome[J].Am J Hum Genet，2005， 77（2）：205-218.

[11]D′haene B，Nevado J，Pugeat M，et al.FOXL2 copy number changes in the molecular pathogenesis of BPES：unique cohort of 17 deletions[J].Hum Mutat，2010，31（5）：E1332-E1347.

[12]Sun M，Ma F，Zeng X，et al.Triphalangeal thumb-polysyndactyly syndrome and syndactyly type Ⅳ are caused by genomic duplications involving the long range，limb-specific SHH enhancer[J].J Med Genet，2008，45（9）：589-595.

[13]Krepelova A，Simandlova M，Vlckova M，et al.Analysis of FOXL2 detects three novel mutations and an atypical phenotype of blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Clin Exp Ophthalmol，2016，44（9）：757-762.

[14]Beysen D，Moumne L，Veitia R，et al.Missense mutations in the forkhead domain of FOXL2 lead to subcellar mislocalization，protein aggregation and impaired transactivation[J].Hum Mol Genet，2008，17（13）：2030-2038.

[15]Kim JH，Bae J.Differential apoptotic and proliferative activities of wild-type FOXL2 and blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome （BPES）-associated mutant FOXL2 protein[J].J Reprod Dev，2014，60（1）：14-20.

[16]程洪波，王濤，王改改，等.一個瞼裂狹小綜合征家系FOXL2基因的突變分析[J].中華醫學遺傳學雜志，2018， 35（4）：515-517.

[17]Pisarska MD，Bae J，Klein C，et al.Forkhead l2 is expressed in the ovary and represses the promoter activity of the steroidogenic acute regulatory gene[J].Endocrinology，2004，145（7）：3424-3433.

（收稿日期：2019-02-18? 本文編輯：祁海文）