柯薩奇病毒B5基因組進化存在結構蛋白編碼區VP4的重組

答 嶸，王 偉

(西安交通大學第一附屬醫院:1.檢驗科；2.神經外科,陜西西安 710061)

柯薩奇病毒B5(CVB5)是小核糖核酸病毒科中腸病毒屬的成員，并且已鑒定出4種不同的血清型(A～D)[1]。 CVB5 與心肌炎和腦炎具有密切關系[2-5]，因此了解CVB5進化的機制將改善相關疾病的控制。CVB5是單正鏈RNA病毒，基因組長7.3 kb，包含5′UTR和3′UTR，P1、P2和P3，衣殼蛋白VP1～4由P1區域編碼。最初在脊髓灰質炎病毒中發現了重組，并且已經提出并通過體外研究證明了復制(模板轉換)和非復制(鏈斷裂和重新連接)機制[6-7]。對已經測序的腸道病毒完整基因組序列的分析表明，重組在非脊髓灰質炎腸道病毒的進化中亦具有重要意義[8-10]。 對CVB5的研究表明，重組可能發生在2C結構域內[11]，這與腸道病毒重組熱點首選在非編碼基因組區域一致。然而，最近的一項研究表明，在埃可病毒30的VP4區域中存在重組基因位點，這是第一次在腸道病毒的蛋白質編碼區中發現重組事件[12]，為了闡明CVB5中是否存在這種現象，本研究通過分析GenBank數據庫中已測序的CBV5基因組序列以研究在蛋白編碼基因組區域例如VP4中是否存在類似的重組事件。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究使用的多個已報道的CVB5病毒分離株的5′UTR和VP1核苷酸序列在GenBank中以FASTA格式檢索。 每個病毒分離株都標記了登錄號、位置和分離年份。 這些序列用于通過最大似然法確定5′UTR和VP1區域的系統發育和通過序列相似性作圖(Similarity plot)分析重組事件。

1.2方法

1.2.15′UTR與VP1進化分析 共檢索到53個CVB5同時含有5′UTR和VP1核苷酸序列，HE998771序列因為在其5′UTR區域中僅有198 nt用于比對，故未納入本研究分析。 其他52個序列使用Clustal W進行多序列比對。對于5′UTR和VP1，根據AF114383的序列，所選區域跨越468 nt至742 nt和2 447 nt至3 295 nt。通過使用基于Tamura-Nei模型的最大似然法推斷進化[13]。在分支旁顯示了相關分類群聚集在一起的樹的百分比。通過將Neighbor-Join和BioNJ算法應用于使用最大復合似然(MCL)方法估計的成對距離矩陣，然后選擇具有優越對數似然值的拓撲，自動獲得用于啟發式搜索的初始樹。 樹按比例繪制，分支長度以每個位點的取代數測量。該分析涉及52個核苷酸序列。所有包含缺口和缺失數據的位置都被消除。進化分析使用MEGA X中構建[14]。

1.2.2基因重組的檢測 長度為845 nt的亞基因組序列(根據AF114383.1從257 nt到1 101 nt)覆蓋部分5′UTR(257 nt至742 nt)，VP4(743 nt至949 nt)和VP2的5′端來自所有可用的32個CVB5序列的(950 nt至1 101 nt)用于檢測重組事件。SimPlot軟件(3.5版本)用于查詢序列和基于5′UTR和VP1簇分組的不同簇中的其他序列之間的相似性圖和步進掃描分析，使用200 nt的滑動窗口大小和20 nt的步長[15]。

1.2.3基因重組的分析 為了確認重組事件，序列480 nt(長度為625 nt至1 104 nt，根據AY875692.1)覆蓋部分5′UTR(625 nt至745 nt)，VP4(746 nt至952 nt)和5′VP2的末端(953nt至1104nt)用于與相關CVB5進行重組分析。 此外，筆者使用Nucleotide BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索了AY875692.1的5′UTR(625 nt至745 nt)和VP2(953nt至1104 nt)在GenBank中最匹配的核苷酸序列，其中JX976772.1/Shandong/2010和KT285000.1/Hong Kong/1972是與AY875692.1最相似的序列用于進行重組分析。

2 結 果

2.1VP1進化分析 將基于CVB5的VP1區序列構建的系統發育樹聚類成3組，其進一步聚類成16個譜系(a至p)。 每個譜系包含1個或多個病毒分離株，并用相同形狀和顏色的相同符號標記。第1組僅包含1個譜系作為a；第2組包含8個譜系，包括b至i；其他譜系包括j至p構成第3組。幾乎所有來自亞洲地區的病毒分離株(除了病毒分離株KP233830和病毒分離株KT285018)聚集在第2組中，而來自歐洲、美洲和澳大利亞地區的大多數病毒分離株聚集到第3組。大多數具有相似分離時間的病毒分離株聚集成相同的譜系。基于VP1的系統發育樹見圖1。

2.25′UTR進化分析 用于VP1系統發育分析的相同病毒分離株同時用于5′UTR區域分析，見圖2。樹被標記為與VP1樹中的譜系一致。 該樹可分為2個分支，4個病毒分離株包括AY875692、MG845892、KF311743和MG845891，改變了譜系分布。 譜系a和b與譜系j～p聚類，但MG845892與譜系h反向聚類。 此外，病毒分離株AY875692顯示出與譜系c分開的簇。其他譜系顯示出與VP1樹相似的分布。

2.3基因重組檢測 通過Similarity plot進一步分析了5′UTR和VP1的系統發育樹的上述不一致的重組事件。使用亞基因組跨部分5′UTR-VP4-5′VP2來檢測重組事件，病毒分離株KF311743.1/China/2011的序列與5′UTR區域的其他譜系高度相似，VP4區域有明顯的相似性降低，VP2區域相似性低。AY875692.1 /Korea/ 2000與j_MG845895.1/USA/2015的5′UTR和MG845892.1/Switzerland/2015毒株VP2的5′末端具有更高的相似性(圖3b)。MG845891.1/Switzerland/2015和MG845892.1/Switzerland/2015的另一序列的圖均顯示這些病毒分離株聚集成3組，并且在具有較低相似性的組中5′UTR-VP4連接處的深度下降(圖3c和3d)。

2.4基因重組分析 為了闡明病毒分離株AY875692.1 /Korea/ 2000的VP4區域中的重組事件，進行序列分析，基因組區域覆蓋部分5′UTR(625 nt至745 nt)、VP4(746 nt至952 nt)和具有相關序列的VP2的5′末端(953 nt至1 104 nt)。病毒分離株序列與5′UTR中的MG845893.1/Switerland/2015和VP2的5′末端的MG845892.1/Switerland/2015高度相似。這3個核苷酸序列之間的比較顯示可能的重組基因座是803 nt和804 nt，見圖4。 JX976772.1/Shandong/2010和KT285000.1/Hong Kong/1972的兩個病毒分離株匹配部分5′UTR和5′end VP2核苷酸序列，相似性分別是93%(E值：4e-40)和92% (E值：3e-52)，見圖5。這3個核苷酸序列之間的比較顯示可能的重組基因座是873 nt和874 nt。可能的2個重組位點均位于VP4區域。

圖2 CVB5 5′UTR區的系統發育分析樹

注：a為KF311743.1/China/2011；b為AY875692.1 /Korea/ 2000；c為MG845891.1/Switerland/2015；d為MG845892.1/Switerland/2015

圖4 AY875692.1 /Korea/ 2000與其他CVB5的重組分析

圖5 AY875692.1 /Korea/ 2000與其他腸道病毒的重組分析

3 討 論

腸道病毒通過突變和重組實現自身進化，但由于缺乏校對活性而且每個新合成的基因組中幾乎有1個突變，誤插入率一直很高[16]。 VP1和5′UTR的系統發育樹均顯示從同一大陸收集的病毒分離株大多數都有聚集到同一組的趨勢，但收集年份比收集的病毒分離株的國家更重要，而那些相似時期的病毒分離株傾向于集群成同一個世系。此前的系統發育分析也表明，在不同年份分離的希臘病毒分離株之間存在25%的差異，這表明腸道病毒類型隨時間演變而不是地理分布[3]。本研究中的趨勢與上述結果類似，支持分離時間在腸道病毒進化中起關鍵作用，可能原因是腸道病毒總是作為準種存在[17]。

通過比較系統發育，VP1和5′UTR的樹不一致表明CVB5病毒分離株中兩個區域之間可能的重組。腸道病毒基因組的不同部分可能因其獨特的作用而獨立發展，5′UTR含有起始位點和內部核糖體進入位點，而在P1區內編碼的衣殼負責病毒進入宿主細胞和組織嗜性。 此外，衣殼也是宿主免疫應答的重要靶標[18]。造成不一致譜系的4個病毒分離株使用亞基因組序列跨越部分5′UTR-VP4-5′VP2進行Similarity plot分析，發現在病毒分離株AY875692.1 /Korea/ 2000中發生重組。然而，病毒分離株KF311743.1/China/2011是一種獨特的病毒分離株，BLAST比對后GenBank中沒有病毒分離株序列與其VP1區域相似。在5′UTR和VP1樹中具有不一致譜系的另外兩個病毒分離株均來自瑞士的未處理污水，但在Similarity plot分析中未顯示重組。

因為只有不超過0.01%的腸道病毒能夠被分離獲取，所以很難系統地研究腸道病毒的進化[19]。可獲得的數據表明重組通常發生在B組腸道病毒的基因組中的幾個基因區域[20]。并且作為HEV-B的成員，在通過系統發育分析證實的CVB5基因型C的進化研究中，其基因組中頻繁重組[21]。CVB5病毒分離株AY875692.1 /Korea/ 2000的重組發生在VP4區域。Similarity plot分析表明，5′UTR的JX976772.1/Shandong/2010和VP2的5′端的KT28000.1 /Hong Kong/ 1972均具有高于0.9的相似值，這表明這兩個病毒分離株可能是這種重組的供體。該研究中的重要性是重組發生在P1區域，其是CVB5的衣殼編碼區，盡管先前的報道表明在除P1區域之外的所有基因組區域中檢測到重組斷裂點[10]。此外，本研究的結果表明，CVB5病毒分離株AY875692.1 /Korea/ 2000是埃可病毒25和豬水皰病病毒的接受者，但是基因組非結構區域內的重組不同(P2和P3)，他們僅在同一物種的成員中被觀察到[19]。腸道病毒衣殼蛋白暴露在病毒體表面，但是VP4蛋白排列在衣殼內部，提示本研究中觀察到的VP4區域中的重組對于依賴于VP1蛋白的功能影響很小。

4 結 論

5′UTR和VP1之間的進化不一致，以及詳細的系統發育分析表明，VP4作為結構蛋白編碼區可能是CVB5進化過程中的候選重組基因座。