黑曲霉低聚葡萄糖氧化酶的分子克隆與生化特征

苑馨瑤,田康明,金鵬,程磊,王正祥*

1(天津科技大學 化工與材料學院,天津,300457) 2(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

低聚葡萄糖氧化酶(gluco-oligosaccharide oxidase，EC1.1.99.B3，Goox)是碳水化合物氧化酶的一種，作用于以α/β-1,4-糖苷鍵連接的低聚葡萄糖，催化氧化還原性末端殘基生成相應的糖酸或內酯[1-3]。寡糖酸具有修復、抗氧化、保濕、促進機體更新等多重功效[4-5]，已應用于食品、化妝品、建筑、醫療、保健等諸多領域[6-7]。現有的乳糖酸、麥芽糖酸和纖維二糖酸多采用化學法制備，其工藝復雜、生產成本高且副產物影響較大[8-9]。Goox的發現使酶法制備寡醛糖酸成為可能。此外，Goox作為食品添加劑應用于纖維含量高的面團中，提高面團的筋度；還可以作為添加劑加入到飼料中，促進雙歧桿菌的增殖，增加腸道對礦物質的吸收[10]；向酶中引入木聚糖底物結合區，可以用來檢測和量化不同低聚糖，也可應用于低聚糖生物傳感儀的構建[11-12]；因此，Goox還可應用于食品、飼料、化工等多個行業，應用潛力巨大。

1991年，LIN等首次在Sarocladiumstrictum中發現Goox，隨后，KIRYU在Paraconiothyriumsp.中也成功分離得到該酶[13-14]。近幾年對該酶的研究主要集中于異源表達、蛋白結構和應用領域方面。2005年，HUANG將來源于S.strictumT1中goox-T1基因在畢赤酵母中實現異源表達，通過對其蛋白結構進行分析，確認該酶的活性位點和催化機制[15]；2008年，KIRYU對來源于Paraconiothyriumsp.的Goox在乳糖酸轉化方面的應用潛力進行研究，結果表明該酶可以有效地將乳糖轉化為乳糖酸，轉化率為100%[13]；2011年，MARYAM通過定點突變將來源于S.strictumCBS 346.7的goox-VN基因在畢赤酵母中實現了異源表達，通過定點突變提高了底物特異性[16]。但目前各項研究也僅圍繞著2個來源的Goox進行，需要進一步研究獲得不同來源的新酶。

本文通過生物信息學分析，從黑曲霉基因組中尋找到一疑似Goox的開放讀框，進一步通過分子克隆技術對其進行克隆表達，并對其酶學性質和生化特征進行分析，為后續應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒

黑曲霉(Aspergillusniger)F0215、大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115和質粒pPIC9K，皆為本實驗室保藏；黑曲霉和大腸桿菌分別采用PDA和LB培養基進行培養。畢赤酵母及其重組菌按照實驗室標準方法進行培養。

1.2 主要試劑

限制性內切酶XbaI、NcoI、SalI以及PyrobestTMDNA聚合酶和T4DNA連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；質粒快速提取試劑盒、DNA純化回收盒，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；cDNA合成試劑盒，Roche公司；辣根過氧化物酶、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖，北京索萊寶科技有限公司；苯酚、4-氨基安替比林，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖和過氧化氫，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 基因克隆與重組菌構建

1.4 重組酶的制備與純化

參考畢赤酵母表達操作手冊對上述重組菌進行發酵，8 000 r/min離心15 min,收集上清液，于-20 ℃保存。發酵上清液經飽和濃度為20%～80% (NH4)2SO4分級鹽析后，再以HiTrap Desalting PD-10脫鹽柱和Sephadex-100凝膠過濾層析柱進行純化。

1.5 重組低聚葡萄糖氧化酶活力測定

酶活測定參照LEE等的方法[18]進行。1 mL反應體系包括：稀釋酶液0.2 mL，0.1 mmol/L 4-氨基安替比林，1 mmol/L苯酚，1 mmol/L乳糖，0.05 U辣根過氧化物酶，0.1 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.0)。55 ℃水浴中反應30 min，冰浴5 min終止反應，測定500 nm下吸光度。以不加底物的反應體系作為空白對照組。酶活定義：每分鐘氧化底物生成1 μmol過氧化氫的酶量為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.6 重組酶酶學性質與特征分析

1.6.1 最適溫度的測定

在不同溫度(40、45、50、55、60、65、70、75、80和85 ℃)下測定其酶活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活，考察溫度對重組酶活力的影響。

1.6.2 溫度穩定性的測定

將酶液分別置于55、65、75、85和95 ℃下保溫4 h，間隔1 h取樣，按照1.5方法測定殘余酶活，以最高酶活力為100%，計算相對酶活。

1.6.3 最適pH的測定

分別以0.1 mol/L磷酸-檸檬酸(pH 5.0～8.0)和碳酸鈉-碳酸氫鈉(pH 9.0～10.0)替換1.5方法中的緩沖液，測定不同pH條件下的酶活力，以最高的酶活力計為100%，計算相對酶活，考察pH值對酶活的影響。

1.6.4 pH穩定性的測定

將酶分別置于不同pH(5.0～10.0)的緩沖液中(終濃度一致)，室溫放置4 h，間隔1 h取樣，測定殘余酶活。以最高酶活力為100%，計算相對酶活。

1.6.5 金屬離子對酶的影響

在反應體系中分別加入終濃度為1 mmol/L的Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Na+、Mn2+和K+，測定其酶活力，以未加金屬離子的酶活力為100%，計算相對酶活。

1.6.6 動力學參數的測定

以不同濃度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖為底物，在重組酶的最適作用溫度和pH條件下進行反應，測定酶活。采用雙倒數法(Lineweaver-Burk)作圖，計算米氏常數Km及最大反應速度Vmax。

1.6.7 底物特異性分析

分別以終濃度1 mmol/L的葡萄糖、木糖、半乳糖、乳糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖為反應底物，測定酶活。以最適底物的酶活力為100%，計算其他底物的相對酶活。

1.7 生物信息學分析

從NCBI數據庫中獲得不同來源的Goox氨基酸序列，利用軟件Clustal X2和Bioedit 7.0.9對這些序列進行多序列比對，并通過MEGA 4.0鄰近法構建Goox進化樹，分析它們親緣關系的遠近。

2 結果與討論

2.1 黑曲霉基因組中存在疑似goox基因讀框

根據現有報道的Goox序列Goox-vn和Goox-T1，利用NCBI數據庫，對黑曲霉基因組序列進行分析發現，黑曲霉基因組中存在一個疑似goox的開放讀框，進一步對來源于黑曲霉的Goox(命名為AnGoox)和Goox-vn、Goox-T1進行序列比對，結果如圖1所示。

AnGoox與Goox-vn和Goox-T1的相似度分別為28.98%和28.71%。在它們的氨基酸序列中，都包含2個較為保守的結構域，一段位置在37～174之間，長度為137的FAD結合域，其起始基序為(PAAI)。另一段在結尾處長度約為44的黃素結構域。通過氨基酸序列比對，可知與FAD進行雙共價連接的關鍵氨基酸殘基為His80和Cys141。參與反應的關鍵氨基酸殘基為Asp377和Try428，2個氨基酸引發底物的氫離子的轉移，從而降低FAD輔因子能量。

2.2 黑曲霉Goox基因的克隆

以黑曲霉F0215的cDNA為模板對Goox基因進行PCR擴增，PCR產物經純化和限制性內切酶XbaI酶切后，與經SnaBI和AvrII酶切的pPIC9K載體連接，通過NcoI酶切，驗證了重組質粒的正確性，獲得重組質粒pPIC-goox。經序列測定與分析發現，goox編碼的氨基酸序列與黑曲霉CBS513.88基因組相應序列有2個堿基的差異，在1310和1410位上，F0215來源的堿基為G和A，參照菌株CBS513.88為A和C，導致2個氨基酸不同(G437E和Q467P)，但其對酶催化活性中心(H80、C141、D377、Y428)無影響(數據未呈現)。

利用MEGA 4.0將不同來源的Goox的氨基酸序列進行比對并構建進化樹(圖2)，此進化樹反映了不同來源的Goox之間的遺傳距離，AnGoox與其他來源的Goox相似度為28.91%～97.46%，其中，AnGoox與已報道的Goox-T1分屬于不同分支，進一步分析發現，AnGoox的氨基酸與A.piperis中的Goox的相似度為97.46%。

2.3 重組Goox的表達與純化

pPIC-goox重組質粒經SalI進行線性化轉化畢赤酵母GS115中，通過G418抗性平板篩選高拷貝。獲得重組菌GS115(pPIC-goox)。在250 mL搖瓶發酵120 h后，檢測發酵液上清酶活，其Goox活力最高為5 mU/mL，因此確認該酶為Goox。

經硫酸銨沉淀和Sephadex-100凝膠色譜純化后，比酶活為0.33 U/mL，純化倍數和回收率分別為16.5和34.7%。進一步經SDS-PAGE分析，蛋白大小約為61 kDa(數據未呈現)，略高于理論值，分析可能存在N-糖基化[16]。

2.4 AnGoox酶學性質分析

2.4.1 最適溫度和溫度穩定性

溫度對AnGoox的活力和穩定性的影響見圖3。AnGoox的最適作用溫度為75 ℃，在70～80 ℃范圍內，其相對酶活在75%以上(圖3-a)；在85 ℃保溫4 h，剩余酶活力在70%以上，在95 ℃保溫4 h，剩余酶活降至約30%(圖3-b)。目前已報道的Goox的最適反應溫度在37～55 ℃之間，S.strictum和Paraconiothyriumsp.來源的Goox在20～50 ℃條件下分別孵育1 h和24 h后，酶活維持在100%，但高于50 ℃酶活力迅速降低，S.strictum的Goox在60 ℃孵育1 h后，殘余酶活僅剩15%，Paraconiothyriumsp.的Goox在60 ℃孵育24 h后，殘余酶活僅為45%[13-14,16]。可見，AnGoox的最適反應溫度及熱穩定性均顯著高于已報道的同類酶。

2.4.2 最適pH和pH穩定性

pH對AnGoox的活力和穩定性的影響見圖4。AnGoox在pH 9.0下表現出最高的酶活力，pH改變則酶活迅速下降，在pH 7.0和pH 10.0下，酶活均降至約40%(圖4-a)。在pH 5.0～9.0保溫4 h后，剩余酶活在70%以上，顯示出較好的pH耐受能力(圖4-b)。AnGoox的最適pH與pH穩定性均與來源于S.strictum的Goox(最適pH=10.0，在pH為5～11條件下，孵育1 h酶活維持在100%)相似[13-14]。

2.4.3 不同金屬離子對酶活的影響

如表1所示，多種金屬離子均對AnGoox表現出激活或者抑制作用，1 mmol/L 的Mn2+對酶活有較為明顯的促進作用，而相同濃度的Fe3+、Ca2+和Ba2+對酶活的抑制作用最為強烈。與來源于S.strictum的低聚葡萄糖氧化酶相比，Zn2+對S.strictum的Goox具有促進作用，而對AnGoox具有抑制作用[14]。

2.4.4 動力學參數

以不同濃度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖為底物，在最適溫度和pH條件下測定酶活，采用雙倒數法，繪制AnGoox的動力學曲線，如圖5所示，求得AnGoox的Km值為0.48 mmol/L，Vmax為2.22 μmol/(L·min)。該酶的Km高于Paraconiothyriumsp.的Goox(0.11 mmol/L)[13]和S.strictum的Goox(0.066 mmol/L)[18]，說明AnGoox對乳糖底物的親和力低于前期報道的2種酶。

2.4.5 底物特異性研究

分別以10種不同的糖作為底物，研究AnGoox特異性，結果如圖6。在10種底物中，AnGoox的氧化能力從高到低依次為麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽五糖、乳糖、纖維二糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖。該酶與S.strictum的Goox底物特異性相似，都具有對單糖、雙糖和麥芽低聚糖的氧化能力[16,18]。AnGoox對麥芽低聚糖氧化能力優于來自S.strictum的Goox，顯示該酶為酶法制備低聚糖酸提供新的可能。

3 結論

本研究首次鑒定了黑曲霉來源的低聚葡萄糖氧化酶，并成功在畢赤酵母中異源表達，系統的酶學性質解析為其后續應用研究提供了基礎材料。